Viernes, 22 de septiembre de 2017

SEPTIEMBRE de 2017
Volumen XXXIV 
N° 353
ISSN 1852-317X

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marzo 2009

Dirofilaria Immitis y Wolbachia: Implicancias Terapéuticas para la Filariosis Cardiopulmonar.

Obiettivi e Documenti Veterinari. Año XXIX. N° 6. nov/dic 2008.
G. Grandi*; M. Leoni*; M. Mortarino **; L. Kramer* y J.W. Mccall ***.

Dirofilaria immitis, el agente etiológico de la filariosis cardiopulmonar del perro y del gato, alberga en su interior una bacteria intraceluar llamada Wolbachia pipientis.  Estos microorganismos que se supone tienen un papel esencial en la biología y en la reproducción de los filaridios, están presentes, salvo algunas excepciones, en el interior de la mayor parte de las especies de filarias hasta ahora examinadas.

Wolbachia. Localización y funciones en los filarideos. En los individuos adultos de D. immitis, Wolbachia, se halla prevalentemente a nivel de células epidérmicas de las cuerdas laterales (Fig. 1 y 2). Las bacterias se localizan en el interior de vacuolas del huésped, reunidas en grupos más o menos numerosos, a partir de pocas bacterias, a menudo concentradas alrededor a los núcleos del Hypoderma hasta formar áreas en las cuales ellas ocupan casi completamente el espacio celular llegando a formar estructuras que recuerdan los bacteriocitos. En el parásito hembra, Wolbachia está presente también a nivel del ovario, oocitos, así como en el interior de los úteros (Figura 3); no se ha demostrado aún la presencia de la bacteria en el sistema reproductivo masculino (Sacchi et al., 2002).

Todas las evidencias científicas obtenidas hasta hoy, parecen sugerir que Wolbachia es un simbionte de los nematodes filarideos, es decir, que la presencia de estas bacterias es esencial para la supervivencia del nematode mismo. Hay diversas características de la relación entre Wolbachia y D.immitis que sugieren la naturaleza simbiótica: (1) todos los individuos hasta ahora observados, provenientes de cualquier área geográfica albergan Wolbachia, con una prevalencia del 100%; (2) la evolución genética de la bacteria recalca la de los nematodes filáridos, como fue evidenciado por estudios filogenéticos; (3) estas bacterias, en la población de los filarideos, es transmitida de la madre a la progenie; la transmisión vertical puede llevar a la instauración de tipos diferentes de la relación huésped-simbionte, entre las cuales la más evidente es una simbiosis mutualística, donde el simbionte aumenta el propio bienestar mediante el incremento del bienestar del huésped que está implicado en la transmisión del simbionte mismo; (4) la remoción de Wolbachia (mediante el tratamiento con antibióticos o radiaciones) lleva a la hembra de los filarideos a la esterilidad y eventualmente a la muerte de los nematodes adultos.

No se ha aclarado exactamente la acción (o acciones) de Wolbachia, que produce esta bacteria tan importante para el huésped filarideo, pero el reciente hecho de completarse el secuenciamiento del genoma y la anotación del pathway metabólico de  presente en el interior de Brugia malayi (Foster et al., 2005) podrían suministrar algunas respuestas.

El huésped filarideo provee al bacterio los aminoácidos necesarios para el crecimiento y la replicación (parece que Wolbachia no sintetiza alguna molécula propia fuera de los péptidoglicanos que componen su pared). Por otro lado Wolbachia sintetiza diversas moléculas que podrían ser esenciales al huésped. Las principales moléculas que podrían pertenecer a esta categoría son: (1) El glutation: los genes responsables de la biosíntesis del glutation podrían ser una fuente de glutation útil a los fines de proteger al nematode del estrés oxidativo o de la acción de las moléculas que disminuyen el sistema inmunitario. (2) Heme producida por Wolbachia podría ser de vital importancia para la embriogénesis del nematode del momento que hay datos que demuestran como la muda y la reproducción están bajo control hormonal, cuya síntesis requiere la presencia de heme misma.  La remoción de Wolbachia podría, por lo tanto,  causar la interrupción de la producción de estas hormonas y sucesivamente la interrupción de la embriogénesis.

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Figura 1: sección transversal de una hembra adulta de Dirofilaria immitis sometida a coloración inmunohistoquímica con suero policlonal anti-wolbachia (X40). Nótense los numerosos cuerpos bactéricos que llenan casi por completo las células de la cuerda hipodérmica lateral.

Figura 2: Sección transversal de un macho adulto de Dirofilaria immitis. Coloración idéntica a la de Figura 1 (X40). Las bacterias son menos numerosas.

Wolbachia y filariosis cardiopulmonar

La filariosis cardiopulmonar del perro se caracteriza por la presencia de lesiones inflamatorias crónicas a nivel pulmonar y en otros órganos debido a la presencia ya sea de nematodes adultos o de microfilarias (Figura 4). Además, luego de una intervención terapéutica adulticida eficaz, como consecuencia, se presentan inevitablemente efectos colaterales de variable entidad, de los más débiles a los más graves, ligados a episodios de tromboembolismo (Figura 5). El librar de Wolbachia de parte de los nematodes en agonía (luego de la terapia adulticida) podría contribuir a la patología pulmonar (Kramer, et al., 2005). Por otra parte, sea en el hombre como en los animales con infestación de filarideos, la masiva liberación de bacterias está asociada a la up-regulation de las citoquinas proinflamatorias, al reclutamiento de neutrófilos y al aumento de inmunoglobulinas específicas (Figura 6).

Las bacterias del género Wolbachia pueden ser removidas del nematode filarideo mediante el suministro de antibióticos al huésped infestado. Diversos estudios demostraron como variados protocolos de tratamiento y de dosajes (la tetraciclina y sus derivados de síntesis parecen ser las más eficaces) se hallan en grado de reducir drásticamente y de eliminar completamente el endosimbionte del nematode huésped. Tal remoción de Wolbachia resultan en efectos claros antifilaria y principalmente:

1.                   Inhibición del desarrollo larvario: se ha demostrado cómo el tratamiento antibiótico de los infestados por filarideos está en grado de inhibir la muda, proceso esencial para la maduración de los nematodes del estado larval a la forma adulta.

2.                   Esterilidad de las hembras de los nematodes: el tratamiento antibactérico lleva, ante todo, a la reducción y en segundo lugar a la desaparición total y constante de las microfilarias. Bandi, et al. (1999) demostraron que ejemplares adultos de D.immitis, obtenidos de perros con infestación natural, tratados con 20 mg/kg. p.v./diario de doxiciclina por 30 días manifestaron alteraciones morfológicas del contenido uterino con una drástica disminución del número de microfilarias, indicando que el efecto bacteriostático estuvo en grado de bloquear la embriogénesis. Pruebas efectuadas en el curso de diversas infestaciones de filarideos en el hombre han provisto resultados similares. Por ejemplo, un ciclo terapéutico de seis semanas a base de doxiciclina emprendido en caso de Onchocerca volvulus, ha conducido al bloqueo de la embriogénesis que persistió hasta al menos por dos años desde inicio del tratamiento (Hoerauf, et al., 2003). Las implicancias de la interrupción del ciclo biológico de estos parásitos son evidentes;

3.                   Efectos adulticidas: este aspecto del tratamiento antibiótico del huésped infestado por el filarideo resulta ser fascinante. Relatos recientes de pruebas de campo con empleo de la doxiciclina, en el hombre permitieron demostrar que diversos regímenes de tratamiento antibiótico dan lugar a efectos claramente macrofilaricidas, evidenciados luego de 12 a 24 meses luego de la aplicación terapéutica (Debra, et al. 2007; Hoerauf, et al. 2007). El motivo de la lentitud con la que el efecto letal de la remoción de Wolbachia se manifiesta sobre los nematodes adultos hasta hoy no es conocido, pero el empleo de un antibiótico para la eliminación de filarideos podría comportar implicancias notables para un programa de tratamientos masivos necesarios para eliminar estas infestaciones debilitantes.

Experiencia personal de la aplicación de la terapia antibiótica en la dirofilariosis cardiopulmonar:

¿Es posible que una terapia antibiótica ejerza el mismo efecto sobre Dirofilaria immitis? En una reciente investigación hemos evaluado de diversos regímenes de tratamiento en perros experimentalmente infestados con individuos adultos de D.immitis sobre parámetros del parásito mismo tal como la microfilariemia , la antigenemia, la presencia de nematodes al final del tratamiento y su contenido de Wolbachia (Bazzocchi, et al., 2008). Cada uno de los perros perteneciente a cuatro grupos (5 perros por grupo) fue tratado con: grupo 1: suministro semanalmente de ivermectina a dosis profiláctica de la dirofilariosis (6µg/kg/p.v.) per os, por 34 semanas; grupo 2: doxiciclina 10 mg/kg p.v./diario, per os en el período comprendido entre las semanas 0-6, 10-12, 16-18, 22-26 y 28-34; grupo 3: ivermectina y doxiciclina asociadas sobreponiendo el mismo dosaje a intervalos de los primeros dos grupos; grupo 4: de control, sin ningún tratamiento. Todos los animales de la experiencia se sometieron a eutanasia en la semana 36° del inicio del ensayo y les fue practicada la necropsia. La experiencia llevada a cabo en la Universidad de Georgia (USA) obtuvo antes de la iniciación, la aprobación del comité de ética de dicha Universidad.

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Figura 3: Sección transversal de una hembra adulta de Dirofilaria immitis. Coloración idéntica a Figura 1 y 2. Notar el tracto reproductivo contendiendo numerosos oocitos y embriones que albergan Wolbachia (X40).

Figura 4: Riñón de perro con filariosis cardiopulmonar. Notar las microfilarias en los glomérulos, positivo a la reacción inmunohistoquímica anti-WSP (flechas; X100).

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Figura 5: Arteria pulmonar de un perro con filariosis cardiopulmonar afectado de grave tromboembolismo luego del tratamiento con melarsamina (flechas; 40X).

Figura 6: Arteria pulmonar de un perro con filariosis cardiopulmonar luego del tratamiento con melarsamina.  Coloración inmunohistoquímica con un anticuerpo anti-wolbachia. El nematode agonizante ha dejado numerosos cuerpos bactéricos en el tejido pulmonar (flechas; 10X).

Los canes tratados solamente con doxiciclina manifestaron una mengua significativa de las microfilarias circulantes, a partir de 12° semana de iniciado el tratamiento. No se observó, sin embargo, algún descenso de la cantidad de antígenos circulantes y la mortalidad de los nematodes resultó sólo del 8,7% en comparación con el grupo de control. En el grupo 2 los resultados de microfilariemia y antigenemia eran similares a los observados en el grupo 1, mientras que la mortalidad certificada fue del 20,3%. Al contrario en el grupo 3 los resultados fueron sorprendentes: las microfilarias circulantes desaparecieron a partir de la sexta semana de comienzo del tratamiento y los niveles de antígenos circulantes habían disminuido al 50%, al finalizar el estudio. En este grupo la mortalidad total de los nematodes adultos resultó del 80% en comparación con los controles. Estos resultados indican que la doxiciclina sola no ejerce efecto significativo sobre los vermes adultos, pero en asociación con la ivermectina está en grado de reducir la población parasitaria de manera importante.

A pesar que el tratamiento fue bien tolerado en todos los animales, no es actualmente aplicable en el ámbito clínico a causa de su duración y del costo. Se está considerando la hipótesis de profundizar y examinar protocolos alternativos de asociaciones que se espera estaran en grado de producir resultados similares y de ofrecer una válida alternativa a la actual terapia adulticida.

*Dipartimento di Produzione Animale Università di Parma.

**DIPAV, Sezione di Patología Generale e Parassitologia, Universita degli Studi di Milano.

***Department of Infectious Diseases, College of Veterinary Medicine, University of Georgia, Athens,

Georgia, 30602, USA.

Traducción: E.G.M.