Daniel Francisco Arencibia Arrebola¹*, Luis Alfredo Rosario Fernández²**, Dayisell Lazara Curveco Sánchez³***.  
Vet. Arg. – Vol.  XXVII -  Nº  269 – Septiembre 2010.

Resumen.
El estudio del potencial genotóxico de nuevos compuestos propuestos como fármacos constituye una vía para la determinación del riesgo de daño genético en las personas expuestas. El ensayo de aberraciones cromosómicas, es fácilmente reproducible y brinda información clara sobre la proliferación celular en médula ósea. Este sistema permite registrar in vivo la capacidad de las sustancias químicas de inducir rupturas cromosómicas o interferir la migración de los cromosomas metafásicos durante la mitosis de células somáticas. En este artículo decidimos evaluar y comparar la respuesta de ratones Balb-C de ambos sexos en la administración de dos sustancias mutagénicas mediante el ensayo de aberraciones cromosómicas en células de la médula ósea. Para lo cual se formaron 4 grupos experimentales/sexo, el primero administrado con Ciclofosfamida por vía intraperitoneal, 48 y 24 horas antes del sacrificio en dosis de 50 mg/kg, el segundo administrado con el mismo mutágeno, dosis y vía pero en una sola administración 24 horas antes del sacrificio, un tercer grupo administrado con Bleomicina por vía intraperitoneal 48 y 24 horas antes del sacrificio en dosis de 20 mg/kg, y un cuarto grupo administrado igualmente con Bleomicina a la misma dosis y  vía pero en una sola administración 24 horas antes del sacrificio. Al final de la experiencia se obtuvieron mayores resultados de inducción de aberraciones cromosómicas con el uso de la Ciclofosfamida, administrada 48 y 24 horas antes del sacrificio en ratones Balb-C de ambos sexos.

Palabras clave: Inducción, ensayo de aberraciones cromosómicas, ratones Balb-C, ciclofosfamida, bleomicina.

Comparison of Balb-C mice response in both sexes in the two mutagenic substances administration by means chromosomal aberration assays in bone marrow cells.

Summary.
The genotoxic potential study of new compounds to propose as drugs constitutes a route for the determination of the risk of genetic damage in people exposed. The chromosomal aberration assay is easily to reproduce and its offers clear information on the cellular proliferation in bone marrow. This system allows registering in vivo the capacity of the chemical substances to induce chromosomics ruptures to interfere or the chromosomes metaphases migration during the mitosis of the somatic cells. In this article we decided to evaluate and compare the Balb-C mice response of both sexes in the administration of two mutagenic substances by chromosomal aberrations assay in bone marrow cells. Which were formed 4 experimental groups/sex, the first Cyclophosphamide administered intraperitoneally, 48 and 24 hours before sacrifice at doses of 50 mg/kg, the second group with the same mutagen, dose and route but on a single administration 24 hours before sacrifice, a third group with bleomycin administered intraperitoneally 48 and 24 hours before sacrifice at doses of 20 mg/kg, and a fourth group administered with bleomycin also at the same dose and route but on a single administration 24 hours before sacrifice. At the end of the experience obtained higher induction results of chromosome aberrations with the use of cyclophosphamide was administered 48 and 24 hours before sacrifice in Balb-C mice of both sexes.  Key words: Induction, chromosomal aberration assays, Balb-C mice, cyclophosphamide, bleomycin.

*Doctor en Medicina Veterinaria y Zootecnia, Aspirante a Investigador.
**Licenciado en Microbiología, Profesor Instructor.
*** Técnico Medio en Farmacia Industrial, Estudiante de la Carrera de Licenciatura en Farmacia.
¹Instituto Finlay, Vicepresidencia de Investigaciones, Calle 17 e/ 198 y 200, Atabey, Municipio Playa, Apartado Postal 16017, Ciudad Habana, Cuba.
²Instituto de Farmacia y Alimento (IFAL, U.H), Calle 222 e/ 25 y 27, La Coronela, Municipio La lisa, Ciudad de la Habana, Cuba.
³Centro de Productos Naturales, Calle 198 e/19 y 21, Siboney, Municipio Playa, Ciudad de la Habana, Cuba. 
Correspondencia a: Daniel Francisco Arencibia Arrebola. Teléfono: 057(07)2715013. Email: darencibia@finlay.edu.cu

Introducción.
El ensayo citogenético in vivo es un ensayo de mutagenicidad a corto plazo, de gran sensibilidad, útil para detectar fundamentalmente aberraciones cromosómicas estructurales en condiciones que involucran la respuesta in vivo, y que pueden variar según la especie y el tejido, generalmente se evalúan durante la primera mitosis consecutiva al tratamiento (1, 2).

Con los mutágenos químicos, la mayor parte de las aberraciones inducidas son de tipo cromatídico. En este método, se utilizan células de médula ósea de mamíferos expuestos, por vías apropiadas, a las sustancias de ensayo y sacrificados a intervalos sucesivos. El tejido diana es la médula ósea por estar más vascularizado y por contener una población de células de ciclo muy corto las cuales pueden aislarse y tratarse con facilidad. En el presente método no se consideran otras especies ni otros tejidos diana (3).

Antes de sacrificarlos, se trata a los animales por medio de sustancias como la colchicina, que actúan como inhibidores del huso, con el fin de acumular las células en una fase de mitosis del tipo metafásico (c-metafase). A partir de las células se efectúan preparaciones de cromosomas secadas al aire y, después, teñidas; a continuación se analizan las metafases en el microscopio para observar las aberraciones cromosómicas (4).

Se utilizan roedores tales como la rata, el ratón o el hámster chino. Se eligen al azar animales adultos jóvenes y sanos, y se reparten en grupos tratados y grupos controles negativos y positivos. Como control positivo se utiliza una sustancia que produzca aberraciones cromosómicas in vivo, incluyendo igualmente en el plan de cada ensayo un grupo control negativo (disolvente) o no tratado (5).

En los controles positivos deberían producirse aberraciones estructurales in vivo con grados de exposición en los que quepa esperar un aumento detectable respecto a la frecuencia espontánea. Las dosis del control positivo deben ser tales que los efectos sean claros, pero no revelen inmediatamente al lector la identidad de los portaobjetos codificados. La sustancia empleada en el control positivo podrá administrarse por una vía distinta de la empleada para la sustancia de ensayo y la toma de muestras podrá realizarse una sola vez. Podrá considerarse la utilización en dichos controles de sustancias de clases químicas afines, cuando sea posible (3-5).

Para la evaluación de nuevos productos en necesario conocer la frecuencia basal de aparición de cada uno de los fenómenos que estudia la toxicología genética, así como la inducida para de esta forma darnos cuenta que estamos frente a una sustancia mutagénica y/o genotóxica, y así corroborar la existencia o no de un efecto mutagénico y en que medida se manifiesta, además al ser estas pruebas tan decisivas en la evolución positiva o negativa de un nuevo producto de índoles diversas es necesario buscar el biomodelo animal ideal.

En este artículo decidimos evaluar y comparar en el biomodelo de ratón Balb-C de ambos sexos, el efecto de dos sustancias mutagénicas la Ciclofosfamida (CF) y la Bleomicina (BL) administradas por vía intraperitoneal (i.p), diferenciado la respuesta a ambos mutágenos cuando son administrados 48 y 24 horas antes del sacrificio y cuando es administrado 24 antes del mismo, en el ensayo de aberraciones cromosómica en células de la médula ósea. Hemos de destacar que escogimos el ratón Balb-C sobre la base de nuestros resultados de indicadores genotóxicos espontáneos donde esta línea de ratón se comporto mejor que otras comercializadas en Cuba, siendo bajo nuestras condiciones experimentales el biomodelo ideal (6,7).

Materiales y Métodos. 
- Animales.

Se utilizaron ratones Balb-C de ambos sexos adultos jóvenes (5-7 semanas), procedentes del Centro de Producción de Animales de Laboratorio (CENPALAB, Cuba), cuyo peso corporal oscilaba entre 25-30 g al termino de la cuarentena (7 días), durante la cual los animales se adaptaron a las condiciones del laboratorio. La temperatura se mantuvo en 25 ± 2º C, la humedad entre 60 ± 10 % y los ciclos de luz- oscuridad fueron de 12 horas. El alimento que se les administró a los animales durante toda la experiencia fue pienso estándar para esta especie preparado en el CENPALAB. El acceso al agua y al alimento fue ad libitum.

-    Administración y dosificación.

En todos los grupos experimentales, la sustancia se administraba en el horario de 10:30-11:30 a.m, y las concentraciones se ajustaron semanalmente en función del aumento del peso corporal. Los animales se distribuyeron aleatoriamente (5 ratones/grupo/sexo/), en cada una de las dos series realizadas para un total de 10  ratones/grupo/sexo/.

En el grupo experimental 1 utilizamos como control positivo la CF en dosis de 50 mg/kg (7), por vía i.p, la cual se diluyó en disolución salina (NaCl) al 0,9 % (8).  La disolución se administró inmediatamente después de ser preparada, 48 y 24 horas antes del sacrificio programado a la misma dosis antes descrita a razón de 10 mL/kg.

En el grupo experimental 2 utilizamos igualmente la CF a la misma dosis y vía que en el grupo anterior, preparándose de la misma forma, la cual se administró inmediatamente después de ser preparada, 24 horas antes del sacrificio programado a razón de 10 mL/kg (7,8).

En el grupo experimental 3 utilizamos como control positivo la BL en dosis de 20 mg/kg (9), por vía i.p, la cual se diluyó en disolución salina (NaCl) al 0,9 % (10). La disolución se administró inmediatamente después de ser preparada, 48 y 24 horas antes del sacrificio programado a la misma dosis antes descrita a razón de 10 mL/kg.

En el grupo experimental 4 utilizamos igualmente la BL a la misma dosis y vía que en el grupo experimental 3, preparándose de la misma forma, la cual se administró inmediatamente después de ser preparada, 24 horas antes del sacrificio programado a razón de 10 mL/kg (9,10).

- Observaciones clínicas.

Se realizaron dos observaciones clínicas diarias, en el horario comprendido entre las 8:30-10:30 a.m y en el horario de la tarde 3:00-4:30 p.m. Durante cada observación se tuvo en cuenta el estado clínico general del animal, lo cual incluyó la palpación para la detección de lesiones, posibles afectaciones respiratorias, del sistema nervioso, cardiovascular, gastrointestinal, estado de la piel, pelo, coloración de las mucosas y ojos.

- Sacrificio.

Todos los animales fueron sacrificados por dislocación cervical con previa atmósfera de éter, en el caso de los grupos experimentales 1 y 3 el sacrificio fue 24 h después de la segunda administración del mutágeno, en el caso de los grupos experimentales 2 y 4 el sacrificio se realizó 24 horas posteriores a la única administración del mutágeno.

- Exámenes realizados.

Ensayo de aberraciones cromosómicas in vivo.
En el horario de la mañana (4 horas antes del sacrificio), la división celular en metafase se detuvo utilizando colchicina (4 mg/kg, vía i.p). Un fémur de cada animal fue extraído y la cavidad medular se lavó con 3 mL de suero bovino fetal (SBF). La suspensión celular se centrifugó, eliminándose el sobrenadante. Después de un tratamiento hipotónico de las células del botón con KCL (0,075 M), se realizó una segunda centrifugación. El botón celular se fijó en una mezcla de metanol-ácido acético glacial (3:1) durante 15 minutos. Se realizaron 3 fijaciones con centrifugaciones sucesivas, y se extendieron en láminas húmedas con enfriamiento previo. Las láminas se secaron al aire y se tiñeron con solución de Giemsa al 10 % durante 30-35 min (11). Se contabilizaron 100 metafases por animal, determinándose el número de células con aberraciones, frecuencia de gaps y de rupturas e intercambios cromosómicos y cromatídicos. También se calculó el índice mitótico IM % (porcentaje de metafases en 1 000 células leíbles) y el número de células con poliploidía en 1 000 células leíbles, todas las determinaciones fueron leídas por dos observadores, para luego establecer un promedio entre ambas (11).

- Análisis estadístico.
Se procedió a verificar los supuestos para realizar el análisis de varianza en la variable continua índice mitótico, los resultados obtenidos están distribuidos normalmente (normalidad,  según el test de Kolmogorov-Smirnov), existiendo dependencia entre las observaciones y presentan homogeneidad de varianzas (test de levene). Por lo cual se analizó con el uso de esta prueba, siendo el nivel de significación establecido de a = 0.05. Las variables categóricas, número de células con aberraciones, frecuencia de gaps y de rupturas e intercambios cromosómicos y cromatídicos, así como el número de células con poliploidía, se analizaron mediante la prueba de Chi-cuadrado, el nivel de significación establecido fue de a = 0.01. Todos los análisis se realizaron empleando el Statsoft for Windows. StatSoft, Inc. (2003). STATISTICA (data analysis software system), versión 6.

Resultados.

En la tabla 1 se observan en una primera instancia los resultados pertenecientes a las aberraciones cromosómicas de tipo numérico tales como el índice mitótico y el número de células con poliploidía, tanto en hembras como en machos la CF administrada a las 48 y 24 horas antes del sacrificio difiere de forma significativa con la CF administrada 24 horas antes del sacrificio y con los dos tratamientos con BL en ambas variables. No existiendo diferencias significativas entre la CF administrada 24 horas antes del sacrificio con los dos tipos de tratamientos en los que se administró la BL.

Por otra parte en una segunda instancia se observan los resultados pertenecientes a las aberraciones cromosómicas de tipo estructural, principalmente aquellas aberraciones que este tipo de ensayo es capaz de detectar con alta especificidad y dentro de estás se destacan un alto número en ambos mutágenos de aberraciones de tipo cromatídica dado por rupturas, tal y como está descrito por estos dos mutágenos. Donde se evidenció la presencia de diferencias significativas en los resultados obtenidos entre la CF administrada a las 48 y 24 horas antes del sacrificio con respecto al otro esquema de tratamiento de este mismo mutágeno y con respecto a la BL en los dos tipos de tratamientos. Por otra parte los otros grupos de tratamiento no difirieron significativamente entre ellos.

Tabla 1. Resultados de la frecuencia inducida de aberraciones cromosómicas en médula ósea de ratones Balb-C de ambos sexos.

^aX ± D.E, De un total de 10 000 células/grupo/serie para un total de 20 000 células evaluadas.

Diferencias significativas (^a p<0.05; ANOVA), estás letras difieren para (a) Comparación entre mutágenos para el mismo sexo y (b) comparación entre los diferentes tratamientos utilizando el mismo mutágeno para el mismo sexo.  
Diferencias significativas (^b p<0.01; prueba no paramétrica χ2), estás letras difieren para (c) Comparación entre mutágenos para el mismo sexo y (d) comparación entre los diferentes tratamientos utilizando el mismo mutágeno para el mismo sexo. 
CF1=Ciclofosfamida administrada 48 y 24 horas antes del sacrificio. CF2=Ciclofosfamida administrada 24 horas antes del sacrificio.  BL1=Bleomicina administrada 48 y 24 horas antes del sacrificio. BL2=Bleomicina administrada 24 horas antes del sacrificio.

Discusión.
Los resultados obtenidos con el uso de la CF 48 y 24 horas antes del sacrifico coinciden con los obtenidos por nosotros con el uso de ratones Balb-C en ambos sexos (7). No siendo así con los obtenidos en cuanto a una sola administración del mutágeno 24 horas antes del sacrificio (7).

Este ensayo se concibió para detectar sustancias que inducen aberraciones de tipo estructural y cromatídica en su mayor expresión, en tal sentido los resultados obtenidos por nosotros en ambos mutágenos y sus variantes de tratamiento corroboran dicha hipótesis, ya que la mayoría de las células con aberraciones son de tipo estructural, cromatídicas dadas por rupturas (1, 3, 4, 7, 8).

Ahora siguiendo un análisis lógico de los resultados la explicación de la existencia de diferencias significativas de la CF administrada 48 y 24 horas antes del sacrificio con la administrada a las 24 horas antes del mismo pensamos que estuvo dado producto a que la CF constituye un promutágeno, por ende para manifestar su efecto genotóxico es necesario que la misma sea metabolizada por el hígado al menos por las enzimas de fase I y de fase II, por ende el tiempo constituye un factor importante y determinante del potencial mutagénico y genotóxico de este clastógeno químico. Por lo cual la CF en ensayos in vitro debe ser utilizada en diseños donde se añada al cultivo la mezcla microsomal hepática S9, para de esta forma mimetizar lo ocurrido en el hígado de roedores (12,13).

En cuanto a la BL no hubo diferencias significativas entre ambos tipos de tratamientos ya que la misma constituye un verdadero mutágeno es decir ella tal y como se administra es capaz de ejercer su efecto mutagénico a altas dosis al ser metabolizada por el hígado en poco tiempo, no como en la CF donde el metabolito activo que se crea de la metabolización en el hígado de está droga es el de mayor efecto mutagénico y genotóxico, causante del daño.

Analizando los resultados entre mutágenos es decir entre la CF y la BL, observamos que solo difirió significativamente la CF administrada 48 y 24 horas antes del sacrificio contra ambos tipos de tratamientos utilizados en la BL, demostrando que la CF administrada en dos ocasiones  (48 y 24 antes del sacrificio), bajo nuestras condiciones experimentales induce mayor número de aberraciones numéricas y estructurales, dado fundamentalmente por el tipo de daño que induce este mutágeno, los cuales son principalmente la formación de monoaductos y enlaces cruzados entre cadenas en consecuencia de la aparición de rupturas por efectos de los mecanismos reparativos (9,14). Mecanismos reparativos que son fijados en las células somáticas y por lo general constituyen procesos irreversibles y trasmisibles a la próxima generación de fijarse igualmente en espermatogonias. Este efecto mutagénico al parecer induce mayor daño que el efecto que realiza la BL en cual es un agente químico radiomimético a la par que en numerosas investigaciones dieron como resultado que un alto % del daño provocado por la BL se repara en un tiempo promedio de 30 minutos en cultivos células de mamíferos (15), el mismo induce labilidad de la estructura del ADN y ruptura del ADN al interactuar con el oxígeno y el hierro produciendo radicales libres (16). La BL se une al ADN a través de su péptido amino terminal y el complejo activado genera radicales libres que se encargan de la ruptura, lo cual trae consigo la aparición de aberraciones sobre todo rupturas de cromátides, huecos, fragmentos y translocaciones, estás últimas en menor medida (17).

Conclusiones.
Se pudo concluir que el mejor diseño experimental para inducir un número considerable de aberraciones cromosómicas en ratones Balb-C de ambos sexos lo constituye la administración de CF a la 48 y 24 horas antes del sacrificio programado en dosis de 50 mg/kg por vía i.p. No obstante se evidenció la alta sensibilidad de esta línea de ratón en ambos sexos a la acción de la CF y BL independientemente del esquema de tratamiento utilizado.

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