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enero 2010

Contenido de ADN y Distribución de la Cromatina en Núcleos Espermáticos Porcinos.

Vet. Arg. – Vol. Nº XXVI I– Nº 261 –  Enero 2010.
Ferrari, MR1; González, LO1; Spirito, SE1; Cisale, HO1*.

Resumen.
El objetivo del presente trabajo fue determinar el contenido haploide de ADN en núcleos de espermatozoides porcinos morfológicamente normales y evaluar algunas características de la distribución de la cromatina (complejo ADN-protaminas). Los estudios se hicieron mediante microespectrofotometría de barrido en núcleos coloreados con la Reacción de Feulgen, usando eritrocitos de pollo como patrón de referencia. El valor medio de contenido haploide de ADN que se obtuvo fue de 2,76±0,12 pg y confirmó datos bibliográficos. La compactación y la distribución de la cromatina espermática se evaluaron por medio de la determinación del área nuclear (21,15±0,79 μm2) y de la relación absorbancia máxima/absorbancia media (3,20±0,12). Estos valores muestran correspondencia con los que se obtuvieron en bovinos, ciervos, ovinos y muflones en nuestro laboratorio, y se alejan de los que presentan equinos y llamas.

Palabras clave: porcinos, núcleo espermático, contenido de ADN, distribución de la cromatina.

1 Área Física Biológica, Laboratorio de Calidad Seminal y Criopreservación de Gametas, Facultad de Ciencias Veterinarias, Universidad de Buenos Aires. Chorroarín 280 CP 1427. Ciudad Autónoma de Buenos Aires. Argentina

* E-mail  cisale@fvet.uba.ar

DNA Content and Chromatin Distribution in Porcine Spermatozoa Nuclei.

Summary.
The aim of the present work was to measure the haploid DNA content in morphologically normal porcine spermatozoa nuclei and to evaluate some chromatin distribution characteristics. Feulgen-reacted spermatozoa were microphotometrically studied taking chicken erythrocytes as reference standard. The haploid DNA content value determined was 2.76±0.12 pg and it confirmed previous bibliographic data. Chromatin compacting and distribution was evaluated by means of nuclear area (21.15±0.70 μm2) as well as by the relation between maximal and mean absorbance (3.20±0.12). These values show agreement with the obtained in bull, deer, sheep and mouflon and differ from horses and llamas values.

Key words: pig, sperm nucleus, DNA content, DNA distribution.

Introducción.
La evaluación del contenido de ADN permite determinar anormalidades en el nivel de ploidía de los núcleos espermáticos. Por otra parte, el conocimiento del contenido de ADN de una especie interesa tanto en estudios evolutivos como de biodiversidad, y también en la estimación de costos en programas de secuenciación de ADN (Gregory y col., 2007). Distintos autores determinaron el contenido haploide de ADN en células somáticas porcinas y obtuvieron valores que oscilaron entre 2.98 pg y 3.47 pg (Vinogradov, 1998; Krishan y col. 2005; Gregory, 2009). Estos estudios se hicieron en diversos tipos celulares (leucocitos, células hepáticas, renales y de pulmón), se utilizaron diferentes métodos de análisis como control de las determinaciones (citometría de flujo, densitometría en células coloreadas con la Reacción de Feulgen, y análisis bioquímicos), y se emplearon varias especies (Homo sapiens, Gallus domesticus, Rana temporaria y Allium cepa) (Gregory, 2009). Greilhuber y col. (1983) trabajando con núcleos espermáticos porcinos obtuvieron un valor de contenido haploide de ADN de 2,79 pg.

La cromatina ocupa prácticamente todo el núcleo del espermatozoide por lo tanto su área y forma están relacionados con la organización de la cromatina (Steinholt y col., 1996). Se mostró que algunas anormalidades en la morfología del núcleo espermático están asociadas a modificaciones en la organización de la cromatina (Ferrari y col., 1998) y, potencialmente, pueden presentar una disminución en la fertilidad (Chemes y Rawe, 2003), demostrando la importancia de contar con parámetros de distribución normales para la cromatina espermática.

Los objetivos del presente trabajo fueron determinar el contenido de ADN y el valor de algunos parámetros de la distribución de la cromatina en células espermáticas porcinas normales.

Material y métodos.
Se obtuvieron muestras seminales por el método de la mano enguantada de dos cerdos fértiles, híbridos, que se encontraban en rutina de extracción de semen en la Facultad de Ciencias Veterinarias – UBA. Los eyaculados utilizados cumplieron con las características necesarias para ser utilizados en programas de Inseminación Artificial.

Reacción de Feulgen.

Sobre cada portaobjeto se hicieron dos extendidos, uno con la muestra de semen y el otro con eritrocitos de pollo. Los núcleos de estos últimos se usaron como control ya que no se dividen y tienen un contenido de ADN estable (Gallus domesticus C-DNA=1,25 pg) (Gregory, 2009). Los extendidos de semen fresco se colorearon con la Reacción de Feulgen (Ferrari y col., 1996). Para ello se fijaron en etanol–ácido acético (3:1, v/v) durante 30 min y luego se lavaron 3 veces en agua destilada durante 10 min cada vez. Posteriormente se hidrolizaron durante 40 min en HCl 5N a 22°C y se lavaron 3 veces en agua destilada. La coloración con el Reactivo de Schiff´s (pH 2,2) se hizo durante 60 min en oscuridad y a 5°C. El material coloreado se lavó 3 veces durante 10 min cada vez en agua sulfurosa (180 ml de agua destilada: 10 ml de bisulfito de sodio al 10%: 10 ml HCl 1N) en oscuridad y a 5°C.

Citometría del complejo Feulgen-ADN.

La medición del complejo Feulgen-ADN se hizo en un microespectrofotómetro de barrido Cytoscan Zeiss Universal (UMSP 30) bajo un objetivo 100x y luz de longitud de onda correspondiente a 560 nm. El equipo realiza, sobre cada núcleo espermático un barrido xy (con paso de 0,25 µm) obteniendo valores de absorbancia. La absorbancia (logaritmo del cociente de la intensidad de la luz incidente sobre la intensidad de la luz transmitida) es directamente proporcional a la cantidad de complejo Feulgen-ADN presente, y por lo tanto es proporcional al contenido de ADN.   Se tomaron como blanco (absorbancia=0) puntos externos a los espermatozoides.

Las mediciones se hicieron sobre núcleos individuales y normales. Se consideraron núcleos normales los que presentaban la morfología más numerosa y homogénea en la población. Todas las mediciones fueron hechas por el mismo operador.

Los parámetros que se determinaron fueron los siguientes: el área del plano principal (A), la absorbancia media (AbMed), que corresponde a la sumatoria de todas las absorbancias medidas sobre un núcleo espermático divididas por el número total de puntos medidos, la absorbancia máxima (AbMáx) que indica el punto del espermatozoide donde el contenido de ADN es máximo y el producto AbMed x A que equivale al contenido de ADN expresado en unidades arbitrarias. La comparación de este último valor con el valor promedio obtenido en el control (eritrocitos de pollo) permitió expresar el contenido haploide de ADN (C-DNA) de cada núcleo en pg. En cada portaobjeto se midieron números similares de núcleos espermáticos de cerdo y de eritrocitos de pollo.

Resultados.
La Figura 1 muestra la imagen microscópica de núcleos espermáticos porcinos de tipo normal coloreados con la Reacción de Feulgen.

En el Cuadro 1 se presentan los valores de contenido de ADN (C-ADN), el área del plano principal del núcleo (A) y la relación entre la absorbancia máxima y la media AbMáx/AbMed. Todos estos valores fueron obtenidos mediante microespectrofotometría de barrido en un pool de 30 núcleos espermáticos normales provenientes de los dos cerdos analizados.

Cuadro 1 Contenido de ADN y parámetros de distribución de la cromatina espermática en porcinos

Especie

C- ADN

(pg)

Área

(μm2)

AbMáx/AbMed

Sus scrofa

2,76±0,12

21,15±0,79

3,20±0,12

La Figura 2 muestra la distribución de medidas de absorción que se hizo en 702 puntos de un espermatozoide porcino. Estos valores, son proporcionales a cantidad de ADN y se observó que el valor máximo se ubicaba en todos núcleos espermáticos en la zona basal, mientras que en la zona media el contenido era menor que en las zonas basal y apical.

Discusión y Conclusiones.
Las determinaciones presentadas en este trabajo se hicieron sobre núcleos espermáticos morfológicamente normales que fueron teñidos con la Reacción de Feulgen. Esta reacción, que es específica y estequiométrica con el ADN, se aplicó bajo condiciones similares a las descriptas para bovinos (Ferrari y col., 1996).

El valor C- ADN (2,76 pg) que se obtuvo en el presente trabajo es muy similar al que muestran Greilhuber y col. (1983) trabajando también con núcleos espermáticos porcinos (2,79 pg). Si embargo, en ambos casos los valores son algo menores que los que obtuvieron otros autores que trabajaban con células somáticas porcinas (2,98 pg – 3,47 pg) (Gregory, 2009). Estos resultados se justifican en el hecho de que la cromatina tiene un grado de compactación mucho mayor en los espermatozoides maduros que en las células somáticas, lo que hace que algunas reacciones citoquímicas reduzcan su intensidad en ellos. Es así como el ADN del núcleo espermático, en su camino entre el testículo y la cola del epidídimo, al aumentar su grado de compactación, va disminuyendo su capacidad de colorearse con Feulgen (Barrera y col., 1993).

El valor de la relación AbMáx/AbMed es indicativo de la forma en que está distribuida la cromatina espermática. Cuanto menor sea dicho valor la distribución de la cromatina será más homogénea. Por otra parte, la comparación del valor del área del plano principal del núcleo espermático entre espermatozoides que tienen un contenido de ADN similar sería un indicador de la compactación y/o de la distribución de la cromatina. Cuanto mayor es el área del plano principal, menor será la compactación de la cromatina o su distribución será diferente. En el presente trabajo, la relación AbMáx/AbMed y el área del núcleo espermático porcino, tienen valores similares a los medidos en ovinos, bovinos, muflones y ciervos (Ferrari y col., 1995, 1998, 2008) lo que indicaría una distribución y compactación similar de la cromatina en estas especies. Sin embargo, los valores de dichos parámetros se alejan de los que se observaron en equinos y llamas (Giuliano y col., 1997; Spirito y col., 2001). Ambas especies poseen un contenido de ADN similar al de las anteriores, pero tiene un área nuclear menor y una relación AbMáx/AbMed mayor.

Agradecimientos.
Agradecemos al Instituto Fitotécnico de Santa Catalina (FCAF, UNLP)-Centro de Investigaciones Genéticas (UNLP-CONICET-CIC) el uso del equipamiento necesario para la realización del presente trabajo.

Este trabajo se realizó con el aporte de la Universidad de Buenos Aires, subsidios UBACyT V028 y V008.

Fig. 1: Núcleos espermáticos coloreados con la Reacción de Feulgen. Los núcleos tienen morfología normal a excepción del indicado con la flecha (piriforme). Aumento ca 2000x

Fig. 1: Núcleos espermáticos coloreados con la Reacción de Feulgen. Los núcleos tienen morfología normal a excepción del indicado con la flecha (piriforme). Aumento ca 2000x

Fig. 2: Distribución del contenido de ADN. a) Representación de todos los puntos medidos sobre un espermatozoide coloreado con la Reacción de Feulgen en un microespectrofotómetro. La mayor intensidad en la gama de grises indica mayor absorbancia y por lo tanto mayor contenido de ADN. b) Representación de la AbMáx determinada en el espermatozoide que se muestra en a) Obsérvese que se encuentra en la zona basal del núcleo espermático. c) Representación de los puntos que tiene una absorbancia  57% de la AbMáx.

Fig. 2: Distribución del contenido de ADN. a) Representación de todos los puntos medidos sobre un espermatozoide coloreado con la Reacción de Feulgen en un microespectrofotómetro. La mayor intensidad en la gama de grises indica mayor absorbancia y por lo tanto mayor contenido de ADN. b) Representación de la AbMáx determinada en el espermatozoide que se muestra en a) Obsérvese que se encuentra en la zona basal del núcleo espermático. c) Representación de los puntos que tiene una absorbancia  57% de la AbMáx.

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