Vet. Arg. – Vol.  XXVII –  Nº  264 – Abril 2010.
Arencibia Arrebola, D. F. ¹*, Rosario Fernández, L. A² **.

Resumen.
El estudio del potencial genotóxico de nuevos compuestos propuestos como fármacos constituye una vía para la determinación del riesgo de daño genético en las personas expuestas. El ensayo de micronúcleos y de aberraciones cromosómicas en médula ósea, son fácilmente reproducibles y brindan información clara sobre la proliferación celular en médula ósea. Estos sistemas permiten registrar in vivo la capacidad de las sustancias químicas de inducir rupturas cromosómicas o interferir la migración de los cromosomas metafásicos durante la mitosis de células somáticas. En este artículo decidimos evaluar las ratas Sprague Dawley como biomodelos experimentales en el ensayo de micronúcleos y de aberraciones cromosómicas en células de la médula ósea, reportando la frecuencia basal de micronúcleos  y aberraciones cromosómicas en médula ósea de ratas Sprague Dawley de ambos sexos; así como la frecuencia inducida de eventos, tras la administración de ciclofosfamida (CF) por vía intraperitoneal, mutágeno de referencia utilizado como control positivo en ambos ensayos. 
Palabras clave: Espontánea, inducida, ensayo de micronúcleos, ensayo de aberraciones cromosómicas, ratas Sprague Dawley, ciclofosfamida. 

Evaluation of Sprague Dawley rats as experimental animal models in the micronuclei and chromosomal aberration assays in bone marrow cells. 
Summary.
The genotoxic potential study of new compounds to propose as drugs constitutes a route for the determination of the risk of genetic damage in people exposed. The micronuclei and chromosomal aberration assay in bone marrow are easily to reproduce and they offer clear information on the cellular proliferation in bone marrow. These systems allow registering in vivo the capacity of the chemical substances to induce chromosomics ruptures to interfere or the chromosomes metaphases migration during the mitosis of the somatic cells. In this article we decide to evaluate the Sprague Dawley rats as experimental animal models in the micronuclei and chromosomal aberration assays in bone marrow cells, reporting the basal frequency of micronuclei and chromosomal aberration in bone marrow of Sprague Dawley rats of both sexes; as well as the events induced frequency after the cyclophosphamide administration by intraperitoneal route (50 mg/kg), mutagen reference used as positive control in both assays. 
Key words: Spontaneous, induced, micronuclei assay, chromosomal aberration assays, Sprague Dawley, cyclophosphamide.

¹Doctor en Medicina Veterinaria y Zootecnia, Aspirante a Investigador.
²Licenciado en Microbiología, Profesor Instructor.
Centro de Trabajo: 
*Instituto Finlay, Vicepresidencia de Investigaciones, Calle 17 e/ 198 y 200, Atabey, Municipio Playa, Apartado Postal 16017, Ciudad Habana, Cuba. 
**Instituto de Farmacia y Alimento (IFAL, U.H), Calle 222 e/ 25 y 27, La Coronela, Municipio La lisa, Ciudad de la Habana, Cuba. Correspondencia a: Daniel Francisco Arencibia Arrebola. Teléfono: 057(07)2715013. Email: darencibia@finlay.edu.cu

Introducción.
La gran cantidad de nuevos productos que son anualmente lanzados al mercado dificulta su total evaluación empleando ensayos en roedores por ser estas pruebas muy largas y costosas. Ello orienta a la utilización de ensayos a corto plazo los cuales, informan en poco tiempo acerca de la actividad mutagénica de dichas sustancias y en algunos casos brindan información suficiente para establecer los niveles de seguridad para el hombre (1,2). En estos ensayos de genotoxicidad se emplea un gran número de sistemas biológicos dentro de los cuales se encuentran: virus, bacterias, hongos, cultivos de células eucariotas, plantas, insectos y mamíferos. Se han propuesto más de 200 ensayos de genotoxicidad, de los cuales se ha obtenido mucha información importante (3).

El ensayo de micronúcleos y de aberraciones cromosómicas de médula ósea de roedores, son ensayos incluidos actualmente dentro de la batería de estudios toxicológicos obligatorios exigidos por las agencias reguladoras (ICH), (4,5) ambos ensayos son fácilmente reproducibles y brindan información clara sobre la proliferación celular en médula ósea (5,6). Estos sistemas permiten registrar in vivo la capacidad de las sustancias químicas de inducir rupturas cromosómicas o interferir la migración de los cromosomas metafásicos durante la mitosis de células somáticas (6).

Para la evaluación de nuevos productos en necesario conocer la frecuencia basal de aparición de cada uno de los fenómenos que estudia la toxicología genética, para entonces de esta forma corroborar la existencia o no de un efecto mutagénico y en que medida se manifiesta, además al ser estas pruebas tan decisivas en la evolución positiva o negativa de un nuevo producto de índoles diversas es necesario buscar el biomodelo animal ideal.

En este artículo decidimos evaluar las ratas Sprague Dawley como biomodelos experimentales en el ensayo de micronúcleos y de aberraciones cromosómicas en células de la médula ósea, reportando la frecuencia basal de micronúcleos y aberraciones cromosómicas en médula ósea de ratas Sprague Dawley de ambos sexos; así como la frecuencia inducida de eventos, tras la administración de ciclofosfamida (CF) por vía intraperitoneal, mutágeno de referencia utilizado como control positivo en ambos ensayos.

Materiales y Métodos.
– Animales.

Se utilizaron ratas Sprague Dawley adultos jóvenes de ambos sexos (6-8 semanas), cuyo peso corporal oscilaba entre 180-200 g al termino de la cuarentena, donde se mantuvieron en condiciones controladas: temperatura (25 ± 2º C), humedad relativa  (60 % ± 10 %) y ciclos de luz- oscuridad de 12 h. El acceso al agua y al alimento (pienso estándar para esta especie suministrado por el CENPALAB), fue ad libitum. Estas características fueron comunes para todos los grupos experimentales evaluados en este ensayo. Toda la manipulación de los animales se realizó de acuerdo con los principios éticos para el uso de los animales de Laboratorio de la República de Cuba.

–  Administración y dosificación.

En todos los grupos experimentales, la sustancia se administraba en el horario de 10:30-11:30 a.m, y las concentraciones se ajustaron semanalmente en función del aumento del peso corporal. Los animales se distribuyeron aleatoriamente (5 ratas/grupo/sexo/estudio), en cada una de las dos series realizadas para un total de 10  ratas/grupo/sexo/estudio.

En el grupo experimental 1 utilizamos animales no tratados como control negativo, a los cuales se les realizaba la técnica de entubación gástrica para que estuvieran expuestos a las mismas condiciones de manejo que los demás grupos, durante un periodo de 14 días.

En el grupo experimental 2 utilizamos el tween 65 al 2 %, el cual es un vehículo utilizado en la mayoría de las preparaciones de sustancias oleosas, útil como agente tensoactivo (7-9), administrado por vía oral 2 mL/kg, durante un periodo de 14 días, preparado 2 horas antes de la administración.

En el grupo experimental 3 utilizamos el NaCl al 0,9 %, ya que esta demostrado que el mismo es el disolvente de la mayoría de las sustancias a preparar (10,11), administrado por vía oral 2 mL/kg, durante un periodo de 14 días, preparado 2 horas antes de la administración.

En el grupo experimental 4 utilizamos como control positivo la CF en dosis de 50 mg/kg, por vía i.p, adquirida a la firma comercial mexicana Lemri SA bajo la marca LEDOXINA, la cual se diluyó en disolución salina (NaCl) al 0,9 % (12). La disolución se administró inmediatamente después de ser preparada, 48 y 24 horas antes del sacrificio programado a la misma dosis antes descrita a razón de 10 mL/kg.

– Observaciones clínicas.

Se realizaron dos observaciones clínicas diarias, en el horario comprendido entre las 8:30-10:30 a.m y en el horario de la tarde 3:00-4:30 p.m. Durante cada observación se tuvo en cuenta el estado clínico general del animal, lo cual incluyó la palpación para la detección de lesiones, posibles afectaciones respiratorias, del sistema nervioso, cardiovascular, gastrointestinal, estado de la piel, pelo, coloración de las mucosas y ojos.

– Sacrificio.

Todos los animales fueron sacrificados por dislocación cervical con previa atmósfera de éter, en el caso de los grupos experimentales 1, 2 y 3 el sacrificio fue 24 h después de la última administración pasados los 14 días, en el caso del grupo experimental 4 tratado con CF, el sacrificio se realizó 24 horas posteriores a la segunda administración del mutágeno (13).

– Exámenes realizados.

Ensayo de micronúcleos en médula ósea de ratas.

Un fémur de cada animal fue extraído y la cavidad medular se lavó por flujo con 4 ml de suero bovino fetal. La médula así obtenida se centrifugó a 1 000 r.p.m. por 10 minutos y tras eliminar el sobrenadante se realizó un frotis del botón celular en láminas portaobjetos. Después de montadas las láminas (mínimo: 2/animal) se mantuvieron 24 horas a temperatura ambiente para su secado y posteriormente se fijaron en metanol absoluto durante 5 minutos, para su posterior tinción en Giemsa al 5% durante 12-15 minutos. Las láminas fueron codificadas, el análisis se realizó por tres observadores independientes y las observaciones fueron realizadas “a ciegas”. Se contabilizó la presencia de eritrocitos policromatófilos (EP) y normocromatófilos (EN) en 2 000 células/animal. Además, se calculó la frecuencia de EP portadores de micronúcleos (MN-EP) en 2 000 EP/animal, según los requisitos establecidos (14). Posteriormente se calculó el índice de citotoxicidad dado por  la relación de EP/EN de la población total de eritrocitos y el número de EP con 1 MN, 2 MN y >2 MN en cada grupo.

Ensayo de aberraciones cromosómicas in vivo.

En el horario de la mañana (2 horas antes del sacrificio), la división celular en metafase se detuvo utilizando colchicina (6 mg/kg, vía i.p). Un fémur de cada animal fue extraído y la cavidad medular se lavó con 3 mL de suero bovino fetal (SBF). La suspensión celular se centrifugó, eliminándose el sobrenadante. Después de un tratamiento hipotónico de las células del botón con KCL (0,075 M), se realizó una segunda centrifugación. El botón celular se fijó en una mezcla de metanol-ácido acético glacial (3:1) durante 15 minutos. Se realizaron 3 fijaciones con centrifugaciones sucesivas, y se extendieron en láminas húmedas con enfriamiento previo. Las láminas se secaron al aire y se tiñeron con solución de Giemsa al 10 % durante 30-35 min. Se contabilizaron 100 metafases por animal, determinándose el número de células con aberraciones, frecuencia de gaps y de rupturas e intercambios cromosómicos y cromatídicos. También se calculó el índice mitótico IM % (porcentaje de metafases en 1 000 células leíbles) y el número de células con poliploidía en 1 000 células leíbles, todas las determinaciones fueron leídas por dos observadores, para luego establecer un promedio entre ambas.

– Análisis estadístico.

Se procedió a verificar los supuestos para realizar el análisis de varianza en las variables continuas frecuencia de EP portadores de micronúcleos, índice de citotoxicidad (EP/EN) y el índice mitótico, los resultados obtenidos están distribuidos normalmente (normalidad,  según el test de Kolmogorov-Smirnov), existe dependencia entre las observaciones y presentan homogeneidad de varianzas (test de levene). Por lo cual  se analizaron con el uso de esta prueba, siendo el nivel de significación establecido de a = 0.05. Las variables categóricas (número total de MN, número de EP con 1 MN, 2 MN y >2 MN, número de células con aberraciones, frecuencia de gaps y de rupturas e intercambios cromosómicos y cromatídicos, así como el número de células con poliploidía), se analizaron mediante la prueba de Chi-cuadrado, el nivel de significación establecido fue de a = 0.01. Todos los análisis se realizaron empleando el Statsoft for Windows. StatSoft, Inc. (2003). STATISTICA (data analysis software system), versión 6.

Resultados. 
En la Tabla 1 se pueden observar los resultados en cuanto al índice de citotoxicidad, dado por la relación EP/EN, y el % de EP portadores de micronúcleos como índice de genotoxicidad, donde se observa una considerable diferencia significativa entre la CF y demás grupos en ambos sexos. Además estos resultados permitieron obtener el rango en que se encuentran cada uno de estos parámetros de forma espontánea en ratas SD de ambos sexos.

A su vez en la Tabla 2 encontramos los resultados deL número total de MN, desglosados según el número de MN internamente como parámetro de grado de genotoxicidad, donde se observa mayor cantidad de MN en el grupo tratado con CF, así como el mayor número de EP con más de 2 MN.

En la Tabla 3 se observan los resultados del ensayo de aberraciones cromosómicas, encontrándose diferencia significativa entre CF y demás grupos tanto en las aberraciones de tipo estructural como numéricas, además se determinó el rango espontáneo de cada uno de estos parámetros dígase índice mitótico, número de células con poliploidía y número de células totales con aberraciones en ratas SD de ambos sexos bajo nuestras condiciones experimentales.

Discusión:
En ninguna de las dos series experimentales tanto en los grupos control negativo como en los grupos tratados con las sustancias vehículos 1 y 2 en ambos sexos se encontraron animales con signos clínicos indicativos de toxicidad, resultados similares se obtuvieron en el grupo de CF igualmente en ambos sexos, lo cual reafirma que la dosis utilizada en cada una de las sustancias utilizadas en este ensayo no fueron altamente tóxicas (12,15). Tal como se puede observar en la tabla 1, no existen diferencias significativas en cuanto al índice de citotoxicidad dado por la relación EP/EN indicador de la proliferación celular en médula ósea, es similar tanto en el control como en las sustancias vehículo 1 y 2, estando como promedio en el rango de 1,18±0,02-1,21±0,06 para esta especie de ratas en ambos sexos, este indicador nos permitió afirmar que la línea de ratas SD constituyen un buen modelo experimental desde el punto de vista de evaluación de la citotoxicidad , ya que este índice se comportó más alto que en líneas de ratones Balb-C y OF-1 (15). De esta misma forma se comporto el índice de genotoxicidad (MN-EP %), el cual no fue modificado con la administración de las sustancias vehiculo 1 y 2 obteniéndose resultados similares a los animales controles. Los resultados obtenidos en este indicador de genotoxicidad nos permitió afirmar que la línea de ratas SD es menos eficiente para este ensayo que las líneas de ratones Balb-C, OF-1 y NMRI, (15,16) ya que en la misma se observó el porciento (%) de eritrocitos policromáticos (EP) espontáneos con micronúcleos con valores relativamente altos comparados con las líneas de ratones antes mencionadas (12, 15, 16).

No siendo así para la CF la cual modificó de forma desfavorable ambos indicadores, al realizar su efecto clastogénico y citotóxico aumentando la formación de micronúcleos y favoreciendo que se formen los llamados retardos anafásicos, llegándose a obtener valores de hasta 0,89 de índice de citotoxicidad, reflejándose como un valor menor de 1, además se observó hasta un 1,74 % de EP con micronúcleos (17). De igual forma se demostró que las ratas SD son menos susceptibles a la CF que los ratones Balb-C y OF-1, al ser comparados con resultados obtenidos en investigaciones realizadas por nosotros, en cuanto a las variables que mide este ensayo (12,15).

Por otra parte el número de EP con 1, 2 o más micronúcleos también fue similar en los grupos tratados con las sustancias vehículos 1 y 2 al compararlos con los animales controles los cuales se encuentran en el rango de 22-32 EP con micronúcleos totales como promedio, algo más alto que los obtenidos por nosotros con el uso de ratones Balb-C y OF-1 como biomodelos experimentales en este ensayo (15) De igual forma que los parámetros evaluados con anterioridad este indicador fue mayor y significativamente diferente en los animales tratados con CF estando en el rango de inducción de 241-250 micronúcleos en las dos series evaluadas. El aumento encontrado en el grupo tratado con CF evidencia la acción citotóxica y clastogénica de este mutágeno de referencia a la dosis y vía de administración empleada en ratas SD, (18) clasificándolo como un potente agente en la formación de micronúcleos en médula ósea de roedores y en particular en esta línea de ratas evaluada por nosotros estando presente su acción en ambos sexos.

Por otra parte en el ensayo de aberraciones cromosómicas según los resultados de la tabla 5, se observa que no hubo diferencias significativas entre las ratas controles y las tratadas con las sustancias vehículos 1 y 2, en ambos sexos, en cuanto a las aberraciones estructurales y numéricas determinadas en este ensayo, permitiéndonos afirmar que bajo nuestras condiciones experimentales el número total de células con aberraciones en ratas Sprague Dawley de ambos sexos se encuentra en el rango de 17-23, así como el número de células con poliploidías se encuentran entre 1-3 resultados que están por encima de los obtenidos por nosotros en ratones Balb-C y NMRI, así como en los obtenidos en los animales controles en otro estudio realizados por nosotros y otros colaboradores, (19,20) a su vez el índice mitótico como promedio fue de 4,81-5,29 % metafases en 1 000 células leíbles, siendo más bajo que los observados en ratones Balb-C y NMRI y en los animales controles utilizados en el estudio de aberraciones cromosómicas del D-003 (19,20).

En tanto la CF demostró su efecto clastogénico obteniéndose resultados estadísticamente diferentes a los obtenidos en los demás grupos de este estudio tanto en el número de aberraciones estructurales como numéricas, observándose una ligera susceptibilidad a la CF por parte de esta línea de ratas en ambos sexos en este ensayo, obteniéndose de 220-246 células totales con aberraciones, el número de células con poliploidías se encontró en un rango de 23-28, resultados que superan los obtenidos por nosotros en un estudio de inducción de aberraciones cromosómicas con este mismo mutágeno en ratones Balb-C y NMRI (19). En tanto el índice mitótico también fue afectado por este mutágeno químico obteniéndose resultados en el rango de 3,40-3,58 % de metafases como promedio en 1 000 células leíbles.

Conclusiones.
Se pudo concluir que la línea de ratas SD constituye un buen modelo para emplear  en ambos ensayos, dada la baja frecuencia espontánea de micronúcleos en médula ósea (índices de genotoxicidad y citotoxicidad), y de aberraciones cromosómicas espontáneas en ambos sexos, además se destacó que no constituye al menos bajo nuestras condiciones experimentales la especie ideal a elegir en el ensayo de micronúcleos, ya que las líneas de ratones Balb-C, NMRI y OF-1, presentan menor número de micronúcleos espontáneos, lo que a nuestro modo de ver los hace ser un mejor biomodelo experimental. En cuanto al ensayo de aberraciones cromosómicas se obtuvieron espontáneamente valores más altos que la línea Balb-C, pero similares a las demás líneas antes mencionadas. Por otra parte se destacó la sensibilidad a la acción de la ciclofosfamida en ambos sexos y en ambos ensayos, administrada en dosis de 50 mg/kg por vía i.p, 48 y 24 horas antes de sacrificio.

Tabla 1. Número total de eritrocitos poli y normocromáticos, índice de citotoxicidad y porcentaje de EP con micronúcleos en médula ósea de ratas Sprague Dawley de ambos sexos.

CF (Ciclofosfamida).^a Administración por vía ip. 
Determinaciones en 2 000 células/animal. 
*p<0.05 (comparación con el control, ANOVA).
(X media; DE desviación estándar, para las dos series experimentales).

Tabla 2. Número total de micronúcleos y de eritrocitos policromáticos con uno, dos o más de dos micronúcleos en médula ósea de ratas Sprague Dawley de ambos sexos.

CF (Ciclofosfamida), ^a Administración por vía ip. 
Determinaciones en 2 000 EP/animal. 
*p<0.01 (comparación con el control, Prueba no paramétrica de χ2, para las dos series experimentales).

Tabla 3. Resultados de la frecuencia espontánea e inducida de aberraciones cromosómicas en médula ósea de ratas Sprague Dawley de ambos sexos.

^aX ± D.E, De un total de 10 000 células/grupo/serie para un total de 20 000 células evaluadas, *p<0.05; ANOVA. 
^b **p<0.01; prueba no paramétrica χ2. Comparación contra el control negativo para ambas pruebas.

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