*López, S. y Koval, A.
Vet. Arg. - Vol. XXVIII - Nº 278 - JUNIO 2011.
Resumen.
Se presentan los resultados de pruebas de potencia en modelo hámster de una vacuna elaborada con la cepa AKRFB del serovar pomona , desafiada con 3 cepas de campo diferentes perteneciente al serogrupo Pomona, aisladas de bovinos en Argentina. Las cepas fueron aisladas y tipificadas por los autores y seleccionadas por su extrema virulencia para este estudio.
La vacuna evaluada resultó satisfactoria, protegiendo a los animales frente al desafío con la cepa vacunal y los 3 aislamientos de campo, confirmando que la elección de la cepa AKRFB para la elaboración de vacuna fue acertada.
Según el conocimiento de los autores, es la primera vez que en Argentina se desafía una vacuna comercial frente a 3 cepas virulentas diferentes pertenecientes al serogrupo Pomona.
Evaluation of vaccine strain AKRFB of Leptospira interrogans serovar Pomona against 3 virulent field strains isolated from bovines in Argentine.
Summary.
Results of potency testing in hamster model of a Leptospira vaccine prepared with the AKRFB strain of pomona serovar, challenged with three different field strains of Pomona serogroup, isolated from bovines in Argentina, are presented. The field strains were isolated and typified by the authors and selected for this study because of their extreme virulence.
The evaluated vaccine resulted satisfactory protecting animals against challenge with the vaccine strain and the 3 field isolates, confirming that the election of the AKRFB strain, as a vaccine strain, was correct.
According to the knowledge of the authors, it is the first time that in Argentina a commercial vaccine is challenged against 3 different virulent strains belonging to the Pomona serogroup.
*Biogénesis Bagó S.A. Ruta Panamericana, Km 38,5 (B 1619 IEA) Garín, Pcia. de Buenos Aires. Argentina.
ariel.koval @biogenesisbago.com
Introducción.
En el Informe sobre leptospirosis en la República Argentina (Comisión Científica sobre Leptospirosis-AAVLD) ¹ se resume la historia de aislamientos de leptospiras en nuestro País, entre los años 1934 y 1996. En el se detallan los serogrupos de las cepas aisladas, las especies animales de las cuales se aislaron las cepas, año de aislamiento, autores y región geográfica.
Cuando se analizan los serogrupos al que pertenecen las cepas aisladas de bovinos, claramente se aprecia el neto predominio del serogrupo Pomona (29 cepas), seguido por Canicola (4 cepas) y finalmente Sejroe² ( cepas pertenecientes al serovar harjo, únicamente aisladas a partir de animales faenados en frigorífico).
Con excepción de las cepas aisladas por la Dra. Draghi ³en el INTA Mercedes de la Pcia. de Corrientes, la mayoría de los aislamientos documentados provienen de rodeos de la Pcia. de Buenos Aires. Este fenómeno no tiene que ver con una distribución geográfica de la enfermedad, sino con la localización de laboratorios especializados capaces de efectuar un aislamiento de esta bacteria.
Desde la publicación de este informe a la fecha, los autores han aislado, tipificado y publicado numerosos aislamientos de Leptospira sp. en bovinos^{4, 5, 6}. En 8 brotes de la enfermedad se aislaron más de 20 cepas, perteneciendo la mayoría al serogrupo Pomona, confirmando que sin lugar a dudas se trata del serovar más importante en los bovinos de la región pampeana. La mayoría de los casos fueron en Provincia de Buenos Aires y solo uno en el sur de Córdoba, por lo cual todavía es desconocida la situación epidemiológica de leptospirosis bovina en vastas zonas del País.
Preservar cepas virulentas de Leptospira con sus atributos originales requiere congelar los aislamientos recientemente efectuados, con un mínimo número de pasajes, en freezer a –90 ºC o directamente en nitrógeno líquido. No se ha podido liofilizar con éxito esta bacteria y el mantenimiento clásico en medios de cultivo por repiques periódicos termina en una rápida pérdida de virulencia.
El pasaje por hámster es inviable cuando se pretende mantener varias cepas por períodos prolongados y tampoco garantiza que las mismas se preserven en estado original.
Lamentablemente la gran mayoría de aislamientos efectuados en Argentina no se preservó de la manera descripta y, por lo tanto, no son útiles para estudios de virulencia, utilización como cepas de desafío o para la elaboración de vacunas.
Considerando la importancia de esta zoonosis es imperioso relevar sistemáticamente la situación epidemiológica en diferentes especies y regiones geográficas para así contribuir al mejoramiento de las herramientas de prevención y control. Desde el año 2004 los autores aíslan, tipifican y preservan cepas virulentas aisladas de brotes de leptospirosis en bovinos y otras especies, buscando hacer realidad un viejo anhelo del Dr. Jorge Mazzonelli: disponer de un banco de cepas virulentas regional. Esta publicación es el primer fruto de muchos años de trabajo en pos de lograr dicho objetivo.
Materiales y Métodos.
Cepas virulentas pertenecientes al serogrupo Pomona.
Cepa AKRFB: aislada de riñón fetal bovino en el año 2007, proveniente de un brote de leptospirosis en un rodeo lechero de la Pcia. de Buenos Aires. Esta cepa se adaptó a los métodos de propagación a escala industrial para la producción de vacuna. Se caracteriza por su alta virulencia y por producir sintomatología nerviosa en los hámsteres inoculados, sin producir hemorragia e ictericia.
Cepa San Luis B 2590: aislada en el año 2003 en un rodeo lechero de la Pcia. de Buenos Aires, a partir de orina de hembras que sufrieron aborto en el último tercio de la gestación.
Cepa Tambo: aislada en el año 2005 a partir de riñón de ternero muerto de leptospirosis, perteneciente a un rodeo lechero de la Pcia. de Buenos Aires.
Cepa El Jabalí: aislada en el año 2007 a partir de orina de terneras de recría I en potrero con antecedentes de muertes de terneras de esta categoría, rodeo lechero de la Pcia. de Buenos Aires.
Vacuna.
Bioabortogen H, serie 125, fecha de elaboración: febrero de 2010. Fecha de Vencimiento: febrero de 2012.
Esta vacuna contiene en su composición virus de IBR y Diarrea Viral Bovina (BVDV), Campylobacter Fetus, Histophilus somni y serovar pomona de Leptospira interrogans (Cepa AKRFB).
Animales experimentales.
40 hámsteres machos, cepa Golden Syrian, con un peso de 70 a 80 gramos.
Tets de potencia.
Se utilizó un test de potencia en hámsteres previamente utilizado por los autores⁷ en el cual se utilizan 5 en lugar de 10 animales por grupo (vacunados y testigos), como se describe en el test de referencia de SENASA. La reducción en el número de animales refleja el compromiso de los autores con los principios de las 3Rs de refinar, reducir y remplazar los animales en ensayos de laboratorio.
La vacuna se diluyó en solución fisiológica 1:40 y se aplicaron 0.25 ml por vía subcutánea a 20 hámsteres divididos en grupos de 5 por jaula. Se reservaron 20 hámsteres de idénticas características para ser utilizados como testigos, también en grupos de 5 por jaula.
Los animales vacunados recibieron una dosis única de vacuna equivalente a 1:800 de la dosis bovina (5 ml).
A los 14 días post vacunación, cada grupo de 5 animales vacunados y 5 testigos se desafió por vía intraperitoneal con 1 ml de cada una de las cepas virulentas descriptas, conteniendo entre 10 y 10000 DL 50 %.
Los animales se observaron diariamente durante 14 días registrando los muertos en cada grupo.
Cultivo de riñones de los animales sobrevivientes.
Finalizado el test de potencia, a los 20 días post desafío, se sacrificaron los animales vacunados sobrevivientes de forma humanitaria con dióxido de carbono. Se efectuó necropsia y siembra del riñón derecho de cada animal en medios de Fletcher y EMJH semisólidos, según metodología previamente descripta^{4, 5, 6}.
Los tubos sembrados se observaron semanalmente al microscopio de campo oscuro para determinar la presencia de leptospiras durante 3 meses posteriores a la siembra.
Resultados.
Test de potencia.
Grupo de animales desafiados con cepa AKRFB (cepa utilizada para elaborar la vacuna).
Testigos (no vacunados): muere el 100 % de los animales al quinto día post desafío, con sintomatología nerviosa característica.
Vacunados: prueba satisfactoria, 80 % de protección (sobreviven 4 de 5 vacunados).
Grupo de animales desafiados con cepa San Luis.
Testigos (no vacunados): muere el 100 % de los animales al quinto día post desafío.
Vacunados: prueba satisfactoria, 80 % de protección (sobreviven 4 de 5 vacunados).
Grupo de animales desafiados con cepa Tambo.
Testigos (no vacunados): muere el 100 % de los animales al quinto día post desafío.
Vacunados: prueba satisfactoria, 100 % de protección (sobreviven 5 de 5 vacunados).
Grupo de animales desafiados con cepa El Jabalí.
Testigos (no vacunados): muere el 100 % de los animales al quinto día post desafío.
Vacunados: prueba satisfactoria, 100 % de protección (sobreviven 5 de 5 vacunados).
Cultivo de riñones.
Animales sobrevivientes desafiados con cepa AKRFB (total 4).
No se recuperan leptospiras de los riñones sembrados.
Animales sobrevivientes desafiados con cepa San Luis B 2590 (total 4).
Se recuperan leptospiras de 2 de los 4 riñones sembrados.
Animales sobrevivientes desafiados con cepa Tambo (total 5).
Se recuperan leptospiras de 3 de los 5 riñones sembrados.
Animales sobrevivientes desafiados con cepa El Jabalí.
Se recuperan leptospiras de 3 de los 5 riñones sembrados.
Discusión.
La vacuna evaluada soportó satisfactoriamente el desafío tanto de la cepa utilizada para la elaboración, como de las 3 cepas virulentas diferentes, confirmando que la elección de la cepa AKRFB como cepa vacunal resultó acertada.
Sin embargo, es interesante lo observado a nivel de la colonización renal. Los animales desafiados con la misma cepa utilizada en la elaboración de la vacuna, no presentan colonización renal, mientras que los animales desafiados con las 3 cepas diferentes, a pesar de sobrevivir al desafío y estar saludables hasta el momento del sacrificio, presentan leptospiras en sus riñones.
Está descripto en la bibliografía que se requiere una mayor masa antigénica para prevenir la colonización renal que la muerte en hámsteres vacunados^{8, 9, 10}.
Este fenómeno ha sido observado en numerosas ocasiones por los autores en ensayos de dosis respuesta con vacunas experimentales, donde animales que reciben dosis subóptimas, además de presentar menores porcentajes de sobrevivencia, los sobrevivientes presentan mayores porcentajes de colonización renal que aquellos vacunados con dosis mayores.
Este fenómeno se verificó con cepas de los serovares canicola, icterohaemorrhagiae y pomona, observándose el mismo comportamiento con cada uno de los serovares estudiados (datos no publicados).
Pero es la primera vez que observamos este fenómeno con diferentes cepas de un mismo serogrupo.
Evidentemente, en algunos animales vacunados la inmunidad alcanza para contener la multiplicación del microorganismo en órganos vitales, evitando la enfermedad y la muerte, pero no es suficiente para evitar la colonización renal.
Estos aspectos observados en animales de laboratorio no necesariamente se van a repetir en las especies domésticas vacunadas, pero deberán ser evaluados en estudios controlados en dichas especies en el futuro.
A partir de la incorporación de la cepa AKRFB a las vacunas no hemos registrado aislamientos de cepas pertenecientes al serogrupo Pomona en rodeos vacunados, con más de 12 millones de dosis aplicadas en 3 años (datos no publicados).
Sin embargo, es importante el continuo relevamiento y aislamiento de las cepas virulentas circulantes en la región para así garantizar la calidad y eficacia de las vacunas disponibles en el mercado.
Cuando se elaboran vacunas con cepas virulentas seleccionadas por su capacidad inmunogénica, representativas de los serovares presentes en una determinada región, y se controlan eficazmente a nivel oficial, inequívocamente constituyen la mejor herramienta para prevenir leptospirosis en los animales domésticos, con un impacto directo en la salud pública, ya que se disminuye enormemente el riesgo de transmisión de la enfermedad al hombre.

Bibliografía:
1) Argento E., Caminoa R. Dragui G., Dorta de Mazzonelli G., Mazzonelli J., Seijo A., Stiebel C. 2002.- Vacunas y Vacunaciones en Leptospirosis. Informe sobre Leptospirosis en la República Argentina. Memorias IIº Congreso Argentino de Zoonosis y Iº Congreso Argentino y Latinoamericano de Enfermedades emergentes. Buenos Aires.
2) Myers, D.M., Jelambi, F. Isolation and identification of Leptospira hardjo from cattle in Argentina. 1975. Trop. Geogr. Med. 27: 63-70.
3) Draghi de Benitez, M.G., Biotti de Cáceres, G. M. 1998 Aislamiento de Leptospira.
interrogans en un cordero de la provincia de Corrientes (República Argentina). Rev. de Med. Vet. 79 (3): 224-225.
4) Koval, A., López, S., Nardello, M., Vena, M.M., Margueritte, J. 2007. Aislamiento, tipificación y evaluación de la capacidad inmunogénica y de protección cruzada de una cepa de Leptospira interrogans perteneciente al serogrupo Pomona. Vet. Arg. Vol XXIV. Nº 235.
5) Licoff, N., Koval, A., López, S., Margueritte, J., Mejía, M. 2008. Brote de Leptospirosis en feed lot: descripción del caso, confirmación diagnóstica y medidas de control implementadas. Vet. Arg. Vol. XXV. Nº 250.
6) Laphitzondo, D., Villa, C., Margueritte, J., López, S., Koval, A. 2009. Aislamiento de Leptospira interrogans serogrupo Sejroe a partir de orina de vaquillona abortada. Vet. Arg. Vol. XXVI. Nº 258.
7) López S., Koval, A.. Reduction in the Number of Hamsters required for Potency Testing of Experimental Leptospira Vaccines.. Symposium: “Practical Alternatives to Reduce Animal Testing in Quality Control of Veterinary Biologicals in the America”. February 18-19, 2010. Buenos Aires-Argentina.
8) Bey, R., Auran, N., Jonhson, R. 1974. Immunogenicity of Whole Cell and Outer Envelope Leptospiral Vaccines in Hamsters. Infection and Immunity. Vol. 10, Nº 5. 1051-1056.
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