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noviembre 2015

Detección inmunohistoquímica del p53 en tumores mamarios caninos: su correlación con otros factores pronósticos.

Vet. Arg. – Vol. XXXII – Nº 331 – Noviembre 2015.
Pereira, M1; Fidanza, M1; Gonzalez, S1; Mantica, F1; Mira, G1

Resumen
En el cánce mamario el estadio clínico basado en el tamaño tumoral, estado ganglionar y metástasis a distancia, ha sido el factor pronóstico de sobrevida más útil y más ampliamente utilizado y difundido. Los avances científicos en biología molecular, hicieron posible estudiar los diferentes aspectos del comportamiento biológico del cáncer de mama. La identificación de diversas alteraciones bioquímicas, moleculares y genéticas en las células neoplásicas, ha permitido el desarrollo de marcadores tumorales que colaboran con la selección de las estrategias terapéuticas beneficiosas para cada paciente y permiten una mejor predicción del tiempo de sobrevida libre de enfermedad, los riesgos de metástasis y las posibles recidivas. El gen p53 es un gen supresor que advierte la presencia de  ADN dañado  provocando un arresto en G1 e induciendo a su reparación. Si esto resulta imposible conduce a la célula hacia la apoptosis. En caso de pérdida homocigótica de p53, el ADN dañado no puede repararse, las mutaciones se convierten en fijas, la célula se divide y progresa hacia la transformación maligna. Numerosos estudios indican que la mutación p53 se asocia a tumores mamarios con altos grados histológicos, elevados índices de proliferación y expresión de Ki67, receptores hormonales negativos y corta sobrevida global y libre de enfermedad.
Palabras clave: p53, factores pronósticos, tumores mamarios caninos.

Immunohistochemical detection of p53 in canine mammary tumors: its implicancy in the survival and its correlation with other prognostic factors.
Summary
In mammary cancer clinical stage based on tumor size, lymph node status and tumoral metastasis has been the most useful survival prognostic factor and most used. Scientific advances in molecular biology made it possible to study different aspects of the biological behavior of mammary cancer. Identification of biochemical, molecular and genetic alterations in neoplastic cells has enabled the development of tumor markers that assist the selection of beneficial therapeutic strategies for each patient and allow better weather forecasting disease-free survival, the risks of metastases and possible recurrence. P53 gene is a suppressor gene that warns the presence of DNA damage causing an arrest in G1 and inducing repair. If this is impossible drives the cell into apoptosis. If homozygous loss of p53, DNA damage cannot be repaired, mutations become fixed, the cell divides and progresses to malignant transformation. Numerous studies indicate that p53 mutation is associated with mammary tumors with high histological grade, high rates of proliferation and expression of Ki67, negative hormone receptors and shorter overall and disease-free survival.
Key words: p53, prognostic factors, canine mammary tumors.

1Cátedra  de Patología Clínica y Enfermedades Médicas, Facultad de Ciencias Veterinarias, UBA. Chorroarín 280. CP 1427. Ciudad Autónoma de Buenos Aires, Argentina. mpereira@fvet.uba.ar
Proyecto subsidiado por  UBACyT  20720130100012BA

Introducción
El cáncer de mama no es una enfermedad con un pronóstico uniforme, ya que se presenta en un grupo de pacientes heterogéneo. La elección de la modalidad terapéutica más conveniente en cada caso se basa en el estudio de los factores pronósticos, es decir aquellas variables que relacionadas con el paciente, con el tumor o con el tratamiento, influyen de forma independiente sobre la evolución de la enfermedad y en la supervivencia total, en el tiempo libre de recaída y en la respuesta al tratamiento.  En Medicina Humana existe acuerdo en considerar validados como factores pronósticos en relación al tumor el estado ganglionar, presencia de metástasis, el tamaño tumoral, el tipo y grado histológico, el grado de diferenciación nuclear. Del mismo modo en Medicina Veterinaria los estudios histopatológicos dan cuenta del grado de infiltración y el grado histológico de malignidad que incluye el grado de diferenciación o grado de anaplasia definida por la apariencia nuclear y el grado de formación tubular y el índice mitótico como el número de figuras mitóticas, entre otros.(1,2,4,5,6,9)  Si bien estos factores son utilizados como de rutina para indicar malignidad y el alto riesgo de recurrencia y metástasis, en Medicina Humana se han producido grandes avances, desarrollando nuevas técnicas de investigación y se han descubierto un gran número de macromoléculas importantes en los procesos biológicos. El uso de  anticuerpos monoclonales permite su detección en cortes tisulares por técnicas inmunohistoquímicas al mismo tiempo que permite evaluar a la misma célula en el contexto del tejido comprometido. (1,2,4,5,6,9)  Muchos investigadores han aplicado estos avances a la medición de biomarcadores en tejidos, células y fluidos, evaluación del estado de los receptores hormonales (RE-RP), la sobreexpresión del c-erbB-2, el estado del p53, la evidencia histológica de invasión vascular y los parámetros cuantitativos de angiogénesis.(1,2,3,7)  El grado de expresión de estos marcadores en el tejido tumoral se analiza a través de procedimientos inmunohistoquímicos que persiguen averiguar en definitiva el grado de proliferación, malignidad y capacidad de invasión de las células neoplásicas. El estado de los receptores hormonales (RE y RP) en Medicina Humana identifica a aquellos pacientes que podrán beneficiarse con la terapia adyuvante endocrina.  Su presencia se asocia a mayor supervivencia y menores posibilidades de  recidivas.(3,5,8,9)  En Medicina Veterinaria el 80% de los tumores mamarios caninos expresan ER, PR o ambos. Según la bibliografía consultada los tumores malignos tienen una expresión más baja de ER con respecto a los tumores benignos y los bajos niveles de ER en tumores malignos primarios se asociaron con ocurrencias de metástasis.(3,5,8,9)  La  pérdida de la función normal de p53 es la alteración genética más común en el cáncer. Ha probado ser una proteína central en oncogénesis por sus propiedades reguladoras del ciclo celular y la apoptosis. Actúa como factor de transcripción nuclear, uniéndose al ADN para regular la transcripción de determinados genes. Monitorea la integridad del ADN impidiendo la división de células genéticamente dañadas.  En el cáncer de mama la mutación del gen con acumulación de la proteína en los núcleos de las células neoplásicas, se asocia a mal pronóstico. En Medicina Humana el p53 aparece mutado en el 40% de los carcinomas de mama mientras que en Medicina Veterinaria entre el 15 y el 30% de los tumores mamarios caninos presentan el gen mutado. Se correlaciona con falta de receptores hormonales, presencia de receptor de crecimiento epidérmico y con mayor agresividad.(5,7,8,9) Marcadores que indican proliferación celular,  que se expresan durante el ciclo celular, tienen utilidad  pronóstica en el cáncer mamario canino del mismo modo que en Medicina Humana.(1,2,6)  Así Ki-67 es una proteína nuclear que se expresa en las células que se encuentran en las fases proliferativas del ciclo celular (G1, S, G2 y M). No reconoce células en la etapa de descanso (G0). La tinción   más  intensa para Ki-67 se encuentra en la fase G2 y M. En Medicina Humana altos porcentajes de Ki-67 se correlacionan con el grado de diferenciación histológica, invasión vascular, posibilidad de metástasis, recurrencia temprana, pobre sobrevida, pérdida de la función normal de p53 y ausencia de receptores hormonales.(1,2,6)   El interés clínico en estos factores pronósticos se relaciona con la posibilidad de adecuar la terapéutica a emplear en cada caso e incrementar la sobrevida global permitiendo el seguimiento de la respuesta al tratamiento y  la objetivación de la progresión de la enfermedad tendiendo a la mejor calidad de vida. El objetivo del presente trabajo es evaluar la sobrevida global en relación  a la expresión del gen mutante p53 e investigar su distribución como  factor pronóstico en tumores mamarios caninos (benignos/malignos) y su correlación con otros factores pronósticos como el antígeno Ki-67 y la presencia o ausencia de receptores hormonales para estrógeno y progesterona.

Materiales y métodos

Muestras
Se trabajó con 34 muestras de tejido neoplásico mamario canino, provenientes del Servicio de Histopatología de la Facultad de Medicina Veterinaria-UBA. Histopatología:

Las muestras fueron fijadas en formalina bufferada al 10% y  procesadas por el método histológico convencional, que consiste en la deshidratación en alcoholes ascendentes y su inclusión en parafina. Posteriormente los cortes de 5 µm, se tiñeron con Hematoxilina-Eosina.

Inmunohistoquímica
Anticuerpos monoclonales utilizados:
Anticuerpo monoclonal de ratón anti-p53 (clon EP9, Cell Marque, Rockling, CA, USA.)
Anticuerpo monoclonal de ratón anti-Ki67 (clon SP6, Cell Marque, Rockling, CA, USA.)
Anticuerpo monoclonal de conejo anti-Receptor de estrógeno (RE clon SP1, Cell Marque, Rockling, CA, USA.)
Anticuerpo monoclonal de conejo anti-receptor de progesterona (RP clon Y85, Cell Marque, Rockling, CA, USA.).
Procesamiento de las muestras:
En primer lugar, las secciones de tejido fueron desparafinadas y rehidratadas. Para la recuperación antigénica se utilizó la técnica Recuperación de Epitopes inducida por calor (HIER) utilizando el reactivo Trilogy de Cell Marque lo que  permitió el desparafinado, rehidratación y recuperación antigénica en forma simultánea. Luego los portaobjetos se lavaron con agua destilada y se incubaron con el anticuerpo primario (dilución 1:100) durante 1 hora a temperatura ambiente, y se lavaron con Tris-solución salina bufferada (TBS). El anticuerpo secundario (Cell Marque, Rockling, CA, USA) se aplicó durante 10 minutos y lavados nuevamente con TBS. El color fue desarrollado a los 5 minutos de incubación con el cromógeno. Por último las muestras fueron deshidratadas y cubiertas con un portaobjetos Las células tumorales fueron consideradas positivas para el antígeno Ki67, RE y PR si presentaban tinción marrón intranuclear.

Evaluación de la inmunomarcación:
Las muestras fueron evaluadas simultáneamente por dos observadores, primero a bajo aumento (×40) y luego, para el recuento de  células con núcleos con tinción positiva, a gran aumento (x400). Se evaluaron 3000 células tumorales y se calculó el porcentaje de células con expresión positiva para Ki67 sobre el total de células tumorales evaluadas. Para p53 y receptores hormonales se calculó el porcentaje de células con expresión positiva considerándose negativo un resultado de menos del 10% de células teñidas y positivo un resultado de más del 10% de células teñidas.

Análisis estadístico
Se realizó un análisis descriptivo de la situación con medidas de posición y con el estudio de las frecuencias de distribución. Se determinó la prevalencia según el tumor (benigno/maligno).  Se realizó análisis de varianza de los resultados obtenidos del estudio de la marcación de p53 y Ki-67 entre los distintos tipos tumorales (benigno/maligno) por el método no paramétrico de Kruskal-Wallis. Se buscaron diferencias significativas entre medias por medio del test de comparación de medias de Kruskal-Wallis. Se analizó la correlación entre los resultados obtenidos de la marcación de p53 y de la de Ki-67. Se analizó la correlación entre los resultados obtenidos de la marcación de p53 y de la  de receptores hormonales. Para  evaluar  sobrevida  global  se  empleó como método estadístico el análisis de supervivencia de Kaplan Meier. La comparación entre ellos se realizó mediante el Test de Logrunk y Cox-Mantel, considerándose  significativos  los  p menores o iguales a 0,05. (10)

Resultados
Del total (n=34) de muestras histopatológicas de tumores mamarios resultaron malignos (n=29/34 85,29%) y benignos (n=5/34 14,71%). Al relacionar el diagnóstico histopatológico (tumor maligno/ tumor benigno) con los resultados obtenidos de la expresión del gen mutante p53 se observó una diferencia significativa entre ambos grupos (p=<0,0005). Al relacionar el diagnóstico histopatológico (tumor maligno/ tumor benigno) con los resultados obtenidos del Ki67 se observó una diferencia significativa entre ambos grupos (tumor maligno, n=29, x=31,1%/ tumor benigno, n=5, x=4,6%  p=<0,0001). En relación al grupo de pacientes con tumores mamarios malignos se observó una  correlación positiva entre los resultados obtenidos de evaluar la expresión del gen mutante p53 y la marcación de Ki67 (p=<0,0001)  y una correlación negativa con los resultados obtenidos de la marcación de receptores hormonales (p=0.001).   El grupo de pacientes con expresión positiva para el p53 mutante presentó diferencias significativas en relación al grupo con expresión negativa con una mediana se supervivencia de 290 y 1050 respectivamente (p=0,0001).(Gráfico Nº1)
Gráfico N° 1
Sin título

Conclusiones
En concordancia con la bibliografía consultada, en relación al grupo de pacientes con tumores malignos se observó una correlación positiva entre la marcación del Ki67 con la expresión del gen mutante p53 ya que el antígeno Ki67 identifica las células proliferantes y el gen p53 se considera un regulador negativo del crecimiento celular. Cuanto mayor es la presencia del antígeno Ki67, más agresivo es el tumor, con mayor invasión vascular y posibilidad de metástasis mientras que la pérdida de la función supresora del gen p53 activa el crecimiento celular  aumentando el riesgo de progresión de la neoplasia. Por otro lado se observó, en concordancia con los autores consultados, una  correlación negativa entre los resultados obtenidos de evaluar la expresión del gen mutante p53 con los obtenidos de la marcación de receptores hormonales puesto que su ausencia se asocia a mayor tasa de recurrencias y mayor riesgo de diseminación. Se concluye  que un adecuado conocimiento de los factores pronósticos y la relación entre los mismos permitirá afrontar el tratamiento de un modo más racional. No obstante se requiere de más estudios que validen dichos hallazgos.

Bibliografía

  1. ANDREA G.K., MARKO H., BRANKA A., et al.: Histopathological evaluation and immunohistochemical study of estrogen receptor α, HER-2 and Ki-67 in canine neoplastic mammary lesions.  Veternarski arhiv., 81 (6), 709-722, 2011.
  2. CASSALI G.D.; FERREIRA E.; SARAIVA B.S.; CAMPOS C.B.; GOBBI H.: E-Cadherin and Ki67 expression in canine mammary hyperplasias and neoplasias.  In Proceedings of the 34th World Small Animal Veterinary Congress WSAVA, São Paulo, Brazil 2009.
  3. ILLERA, J.C.; PÉREZ-ALENZA, M.D.; NIETO, A.; JIMÉNEZ, M.A.; SILVAN, G.; DUNNER, S.; PEÑA L.: Steroids and receptors in canine mammary cancer. Steroids 71:541-548, 2006.
  4. KADTHUR, S. et al.: Prognostic Value of Ki 67 Proliferation Antigen in Canine Malignant Mammary Gland Tumours. Braz J Vet Pathol. 4(1), 36-40, 2011.
  5. KLOPFLEISCH R, GRUBER A.D.: Differential expression of cell cycle regulators p21, p27 and p53 in metastasizing canine mammary adenocarcinomas versus normal mammary glands. Res Vet Sci. Aug;87(1):91-6. doi: 10.1016/j.rvsc.2008.12.010, 2009.
  6. LANGE, C.A.: Integration of progesterone receptor action with rapid signaling events in breast cancer models. J. Steroid Biochem. Mol. Biol. 108:203-212, 2007.
  7. MARDANPOUR K, RAHBAR M.: Steroid hormone receptors, MIB-1, p53, and c-erb-B2 expression on breast cancer: Comparison of immunohistochemistry on cell block and fine needle aspiration and tissue sample, in northwest Iran. Caspian J Intern Med., 3(4):523-9, 2012.
  8. SANTOS AA, LOPES CC, RIBEIRO JR, MARTINS LR, SANTOS JC, AMORIM IF, GÄRTNER F, MATOS A.J.: Identification of prognostic factors in canine mammary malignant tumours: a multivariable survival study. BMC Vet Res. Jan 4;9:1. doi: 10.1186/1746-6148-9-1, 2013.
  9. VINOTHINI, G.; BALACHANDRAN, C.; NAGINI, S.: Evaluation of molecular markers in canine mammary tumors: Correlation with histological grading.  Oncology Research Featuring Preclinical and Clinical Cancer Therapeutics. 18(5-6), 193-201, 2009.
  10. WATSON, P.; PETRI, A.: Statistic for Veterinary and Animal Science, 2nd ed. Blackwell Science, London 243, 2000.