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abril 2020

Expresión del factor de crecimiento de endotelio vascular (vegf) en pacientes caninos con cáncer mamario.

Vet. Arg. – Vol.  XXXVII –  Nº 384 –  Abril 2020.
Pereira, M.*1; Fidanza, M.1; Vartabedian, A.1; Gabriele, C.1

Resumen
La angiogénesis es esencial para el desarrollo, crecimiento, invasión y metástasis del tumor y podría participar en la progresión de neoplasias de bajo a alto grado. En el cáncer de mama, la angiogénesis es un indicador importante de supervivencia y respuesta terapéutica. El factor de crecimiento de endotelio vascular (VEGF) se considera uno de los factores angiogénicos más específicos y potentes y un objetivo terapéutico importante en el cáncer de mama. El VEGF-A es el principal mediador de la angiogénesis tumoral. Además podría promover la metástasis mediante la inducción de la proliferación de células endoteliales, contribuyendo a la formación de nuevos vasos, la producción de colagenasa y otras enzimas degradantes que facilitan el escape de células neoplásicas de la masa a la vasculatura y la estimulación del crecimiento de células neoplásicas, aumentando el riesgo de crecimiento y diseminación tumoral. En el cáncer de mama en la medicina humana, la alta expresión de VEGF se ha asociado con un riesgo metastásico elevado y un pronóstico pobre. En estudios caninos, se sugirió que un aumento en la expresión de la proteína VEGF estaba relacionado con factores de mal pronóstico.  La detección de marcadores tumorales se suma a los estudios histopatológicos y a los análisis hematológicos y bioquímicos realizados de rutina a pacientes caninos con cáncer mamario, en una búsqueda e identificación constante de factores que contribuyan a predecir el comportamiento biológico del tumor y permitan adecuar las posibilidades terapéuticas a seguir.
Palabras clave: Angiogénesis, Factores pronósticos, Cáncer mamario canino.

Vascular endothelial growth factor (vegf) expression in canine patients with mammary cancer.

Summary
Angiogenesis is essential for tumor development, growth, invasion, and metastasis and could participate in the progression from low to high grade neoplasms. In breast cancer, angiogenesis is an important indicator of survival and therapeutic response. Vascular endothelial growth factor (VEGF) is considered one of the most specific and potent angiogenic factors an important therapeutic target in breast cancer.  VEGF‐A is the main tumor angiogenesis mediator.  VEGF could promote metastasis by induction of endothelial cell proliferation, contributing to the formation of new vessels, the production of collagenase and other degradative enzymes facilitating neoplastic cell escape from the mass into the vasculature and stimulation of neoplastic cell growth, increasing the risk for tumor growth and tumor dissemination. In breast cancer in Human Medicin, high VEGF expression has been associated with an elevated metastatic risk and poor prognostic. In canine studies, an increase in VEGF protein expression was suggested to be related to poor prognostic factors. Tumor markers detection in additionto histopathological studies, and routine hematological and biochemical analyzes performed on canine patients with mammary tumors in a constant search and identification of factors to predict the biological behavior of the tumor and terapeutic posibilities.
Keywords: Angiogenesis, Prognostic Factor, Canine mammary cáncer.
1Cátedra  de Patología Clínica y Enfermedades Médicas, Facultad de Ciencias Veterinarias, UBA. Chorroarín 280. CP 1427. Ciudad Autónoma de Buenos Aires, Argentina.
*e-mail: mpereira@fvet.uba.ar

Introducción
La angiogénesis es un proceso esencial en el tumor primario para crecer e invadir estructuras adyacentes. El grado de densidad microvascular intratumoral refleja la actividad angiogénica generada por las células neoplásicas y el estroma. El aumento de la angiogénesis está asociado a un diagnóstico desfavorable en enfermedades neoplásicas. El incremento del número de vasos sanguíneos aumenta la superficie de contacto entre las células tumorales y las rutas de escape potencial, aumentando la probabilidad de extravasación.(1,2) Por otro lado los vasos sanguíneos tumorales desarrollan una morfología distinta al sistema vascular fisiológico.
La neovasculatura presenta un trayecto sinuoso con zonas dilatadas y en general carece de pericitos funcionales. Las paredes de los vasos del tumor son finas y se pueden componer de células endoteliales y células del tumor. Son también extremadamente permeables, debido en parte a la presencia de fenestraciones y a la carencia de una membrana basal.(1,2,3,5) El proceso está controlado por factores angiogénicos y angioestáticos que influyen en la proliferación, diferenciación y organización de células endoteliales. Está inducido por rutas de señalización transformante y por la hipoxia tumoral dando lugar a la expresión de factores angiogénicos producidos por la célula tumoral tal como el factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF) y el factor de crecimiento placentario (PLGF). Por otro lado, varios tipos de células del estroma tumoral contribuyen en el proceso angiogénico. Las células endoteliales secretan factores angiogénicos que afectan al estado de activación del endotelio y su
diferenciación dentro de los vasos maduros. Los macrófagos y mastocitos que infiltran el tumor producen factores angiogénicos como VEGF, factor de crecimiento fibroblastico (FGF-2), interleucina-8 (IL-8), y metaloproteinas (MMPs) que promueven el crecimiento tumoral en todas sus etapas. Células inmunes y fibroblastos anormales asociados al cáncer pueden generar
factores que actúan como proangiogénicos del mismo modo que algunas citoquinas modulan la matriz extracelular estimulando a las células tumorales.(1,2,4,7,10,11)
El VEGF es un importante regulador de la angiogénesis y de la permeabilidad vascular. Existen al menos cuatro miembros en la familia de VEGF (VEGF-A, B, C y D). El más importante de ellos es el VEGF-A. Es considerado el mitógeno más potente para células endoteliales cumpliendo un papel fundamental en este proceso. Su sobreexpresión está asociada a una mayor progresión tumoral. (8, 9, 10, 11)  En el cáncer de mama es indicador de pronóstico desfavorable ya que se asocia con recidivas. Se ha observado que el patrón de expresión citoplasmático difiere entre las células tumorales mamarias benignas y malignas. En tumores benignos un pequeño número de células contienen pocos gránulos pequeños, débilmente positivos, de VEGF; en
contraste, en los carcinomas se observa un gran número de células que a menudo contienen gránulos grandes fuertemente positivos, dispersos de forma difusa en el citoplasma. (1, 5, 6,7)

El estudio de la angiogénesis permite evaluar el riesgo de metástasis y la posible recidiva; mejora la predicción del tiempo de sobrevida libre de enfermedad y permite evaluar posibilidades terapéuticas a fin de lograr una calidad y expectativa mayor de vida en pacientes con neoplasias mamarias.

El objetivo del presente trabajo fue  investigar la expresión de VEGF  como  factor pronóstico en tumores mamarios caninos.

Materiales y métodos
  Muestras
Se trabajó con 12 pacientes caninos con tumores de mama, 2 de tipo benigno y 10 de tipo maligno, provenientes del Servicio de Histopatología de la Facultad de Medicina Veterinaria-UBA.

  Histopatología
Las muestras de tejido mamario fueron fijadas en formalina bufferada al 10% y procesadas por el método histológico convencional, que consiste en la deshidratación en alcoholes ascendentes y su inclusión en parafina. Posteriormente los cortes de 5μm, se tiñeron con Hematoxilina-Eosina.

  Inmunohistoquímica
    Anticuerpos monoclonales utilizados:
Anticuerpo monoclonal de ratón anti- VEGF, Santa Cruz, Biotechnology, CA, USA.

    Procesamiento de las muestras
Para la detección del VEGF las secciones de tejido fueron desparafinadas y rehidratadas. Se realizó tratamiento térmico para la recuperación antigénica utilizando tampón de citrato de sodio 10 mM a pH 6.0 y a 95 ° C durante 5 minutos. Posteriormente se lavaron con agua desionizada. Luego se incubaron con el anticuerpo primario (dilución 1:100) durante 1 hora a temperatura ambiente, y se lavaron con Tris-solución salina bufferada (TBS). El anticuerpo secundario (Santa Cruz, Biotechnology, CA, USA) se aplicó durante 10 minutos y lavados nuevamente con TBS. El color fue desarrollado a los 5 minutos de incubación con el cromógeno. Por último las muestras fueron deshidratadas y cubiertas con un portaobjetos.

    Evaluación de la inmunomarcación
Las muestras fueron evaluadas a bajo aumento (×40) y luego, para el recuento de  células con tinción positiva, a gran aumento (x400). A partir del porcentaje de células marcadas se establecieron los siguientes grupos: 0: 0-24%, 1: 25-49%, 2: 50-74%, 3: ≥ 75%, estableciéndose para el análisis binario el punto de corte en el 50%, considerando tinciones positivas las que superaban este punto de corte.

  Análisis estadístico
Se realizó un análisis descriptivo de la situación con medidas de posición y con el estudio de las frecuencias de distribución. Para  evaluar  sobrevida  global  se  empleó el método estadístico de análisis de supervivencia de Kaplan Meier. La comparación entre ellos se realizó mediante el Test de Logrunk y Cox-Mantel, considerándose  significativos  los  p menores o iguales a 0,05.(12)

Resultados
Del total (n=2) de muestras histopatológicas pertenecientes a pacientes con  tumores mamarios benignos el l00% (n=2/2) presentaron expresión negativa para el VEGF.  Del total (n=10) de muestras histopatológicas pertenecientes a pacientes con  tumores mamarios malignos el 60% (n=6/10) presentaron expresión positiva para el VEGF y el 40% (n=4/10) presentaron expresión negativa. El grupo de pacientes con expresión positiva para el VEGF presentó diferencias significativas en relación al grupo con expresión negativa, con una mediana de supervivencia de 175 y más de300 días respectivamente (p=0,0095).  Del total (n=6) de muestras con expresión positiva para el VEGF el 66,67% (n=4/6) resultaron ser adenocarcinomas simples y el 33,37% (n=2/6) tumores mixtos malignos, mientras que del total (n=4) de muestras con expresión negativa para el VEGF el 75% (n=3/4) resultaron ser adenocarcinomas compuestos y el 25% (n=1/4) adenocarcinomas simples. Del total (n=6) de muestras pertenecientes a pacientes  con expresión positiva para el VEGF el 50% (n=3/6) presentaron metástasis.

Conclusiones
En concordancia con la bibliografía consultada, la expresión positiva del VEGF se asoció a corta sobrevida global, rápido crecimiento y progresión tumoral  con alta posibilidad de metástasis y recidiva  del tumor lo cual se observó en el 80% de los adenocarcinomas simples y en el 100% de los tumores mixtos malignos. El estudio de la angiogénesis permite evaluar el riesgo de metástasis y mejora la predicción del tiempo de sobrevida libre de enfermedad.(1,2,5,6) No obstante se requiere de más estudios que involucren un mayor número de pacientes y que validen dichos hallazgos.

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