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abril 2020

Presencia de salmonella en huevos de granjas particulares de Asturias. España.

Vet. Arg. – Vol.  XXXVII –  Nº 384–  Abril 2020.
*Araceli Fernández Alonso, Micaela Elena Manzat Verinca, Anaí Rodríguez Aguilar.

Resumen
El consumo de huevo va en aumento ya que es considerado un alimento sano y de gran valor nutritivo. Su consumo es cada vez más significativo, dada la actual tendencia de los consumidores de adquirir productos “naturales” como los huevos producidos en granjas pequeñas o casas particulares. En este tipo de producción nos encontramos con el problema de la falta de higiene y de controles sanitarios. En la Unión Europea, según informes de la Autoridad Europea de Seguridad Alimentaria (EFSA) y el Centro Europeo para la Prevención y el Control de Enfermedades (ECDC) sobre Zoonosis y Brotes de Enfermedades de Transmisión Alimentaria, Salmonella aparece como la segunda causa más frecuente de enfermedad transmitida por alimentos. Nuestro estudio se realizó con el objetivo de identificar la presencia de Salmonella en huevos de gallinas (Gallus gallus) criadas en granjas particulares y al aire libre. Se realizó determinación de Salmonella spp. en 186 muestras de huevos frescos procedentes de diferentes lugares de Asturias y León. El estudio bacteriológico se realizó sobre la cáscara, siguiéndose un protocolo inicial de enriquecimiento selectivo, un posterior cultivo en un medio selectivo y diferencial y para la identificación final se utilizaron pruebas bioquímicas. No se aisló Salmonella en ninguno de los 186 huevos analizados.

Palabras clave: Salmonella spp., huevos, granja particular, zoonosis, productos naturales.

Presence of salmonella in eggs of private farms of Asturias. Spain.
Summary
The egg consumption is increasing as it is considered a healthy and nutritious food. His consumption is increasingly significant due to the current tendency of consumers to buy “natural” products such as eggs produced in small farms or private houses. In this type of production, we can find the problem of lack of hygiene and sanitary controls.

In the European Union, according to reports from the European Food Safety Authority (EFSA) and the European Center for the Prevention and the Control of Diseases (ECDC) on zoonoses and outbreaks of foodborne diseases, Salmonella appears as the second cause or foodborne illness.

The goal of our study was to identify the presence of Salmonella in eggs of hens (Gallus gallus) breeded in private farms, and free range eggs.

Salmonella spp. detection was performed on 186 samples of fresh eggs from different places of Asturias and León. The bacteriological study was carried out on the eggshell following an initial protocol of selective enrichment, a subsequent culture in a selective and differential medium and biochemical test were used for the final identification. Salmonella was not isolated in any of the 186 eggs analyzed.
Keywords: Salmonella spp., eggs, private farm, zoonoses, natural products.
* aracelifernandezalonso@gmail.com

Introducción
Salmonella spp. es un patógeno primario de nivel 3 (1) y de difícil aislamiento. Causa intoxicación alimentaria y salmonelosis, que es transmitida al hombre por el consumo de alimentos contaminados, principalmente carne fresca y procesada, aves de corral, huevos y productos vegetales frescos. (2)

La infección por Salmonella tiene un periodo de incubación de 6-48 horas y normalmente causa gastroenteritis con náuseas, vómitos, diarrea, dolor abdominal y fiebre. En algunos pacientes la enfermedad invasiva puede producir lesiones en múltiples órganos y ser mortal (con una tasa de mortalidad estimada en el 2% de los casos, alrededor de 200 fallecimientos al año en EU) o manifestar secuelas a largo plazo, como artritis reactiva. (3)

Los serotipos aislados con más frecuencia son enteriditis y typhimurium. (4) Estos serotipos producen infección asintomática en muchas especies animales, por ejemplo, en las gallinas, que son el objeto de nuestro estudio, pero en el ser humano puede causar graves trastornos. (5) Según datos de la Red Nacional de Vigilancia Epidemiológica, Salmonella spp. se identificó como el agente etiológico en el 98% de los brotes transmitidos por huevos y ovoproductos (5). A partir del año 2013 en España se confirmaron 9.819 casos de Salmonella spp. De los serotipos identificados, los más abundantes fueron S. typhimurium, 35,08% y S. enteriditis con el 24,09%. Desde el año 2015 al 2016 se ha producido un ligero aumento en el número de casos confirmados, pasando de los 3.443 a 3.558 casos. (6)

Se ha comprobado que S. enteriditis causa infecciones sin signos clínicos aparentes en una amplia gama de especies animales especialmente las aves domésticas. Sin embargo, los portadores sanos pueden diseminar la infección por la contaminación fecal de la carne y huevo, o infectarse en el ovario en el momento de la ovulación. (5)

Las explotaciones avícolas deben incluir medidas de bioseguridad y todas aquellas que eviten o reduzcan la presencia de Salmonella spp. Las vacunas son un elemento crucial para controlar la infección sistémica y la contaminación de los huevos en las ponedoras, porque inducen una protección rápida que evita la colonización. (7) (8). La resistencia de los pollos a enfermedades intestinales y a la colonización del intestino aumenta con la edad, debido al rápido desarrollo de microflora intestinal por el contacto con animales adultos. (7)

La UE tiene establecido como objetivo la reducción de la prevalencia de S. enteriditis y S. typhimurium, por lo que se han protocolizado acciones como la vacunación de los pollos.

Se ha demostrado que la activación de los macrófagos por los linfocitos T auxiliares (Th1) y los linfocitos T citotóxicos γ/δ desempeña un papel fundamental en la respuesta inmunitaria. Estas células necesitan ser activadas por una vacuna que imite las infecciones naturales, como es el caso de las vacunas vivas. Esto no significa que las vacunas inactivadas no puedan tener un efecto protector, pero inducen sobre todo respuestas humorales que son más eficaces frente a las bacterias extracelulares, siendo Salmonella spp. un patógeno intracelular. En cualquier caso, también se ha demostrado el valor de las vacunas inactivadas. (8)

En general, se considera que las vacunas vivas confieren mayor protección porque desencadenan tanto la respuesta celular como humoral, mientras que las vacunas inactivadas estimulan sobre todo la producción de anticuerpos.

En un primer paso, las vacunas puestas inhiben la colonización. En 24 horas se genera una exclusión microbiana inespecífica que reduce la colonización intestinal y la invasión sistémica. Después se produce la inmunidad celular que conduce a la eliminación de las células infectadas por las bacterias de Salmonella a las que los anticuerpos no pueden acceder.

Por último, la IgA secretora activa una respuesta inmunitaria local específica para neutralizar las bacterias Salmonella virulentas antes de que atraviesen la pared intestinal. (8)

Con esto se ha conseguido que, aunque la producción de los huevos se realice en granjas pequeñas y que están fuera del circuito de producción masiva, cuando las gallinas son adquiridas, ya han sido vacunadas y la bacteria se encuentra controlada.

El Sistema de Información de Brotes de la Red Nacional de Vigilancia Epidemiológica (RENAVE) informa de que, en los brotes de transmisión alimentaria, el alimento más frecuentemente identificado fue el huevo y/o derivados en el 44,1% de los brotes. (9)

Para verificar la inocuidad de los huevos de granja es interesante realizar estudios de la presencia de Salmonella spp. en huevos fuera del circuito de comercialización habitual (tiendas de alimentación en sus distintas variantes).

Investigaciones de la Universidad Central del Ecuador en Ecuador, afirman que la prevalencia de Salmonella enteriditis es de 0.0133% con un total de 150 huevos analizados. (10) Otro estudio realizado sobre 230 huevos de granja en Tunja, Colombia, indica una prevalencia de 1.74% de Salmonella spp. (11)

En España según el reporte anual del 2016 de EFSA (European Food Safety Authority) para la monitorización de Zoonosis, de un total de 109 huevos analizados en diversos puntos como granjas, tiendas de alimentación, restaurantes, servicios de catering, cafeterías y almacenes de distribución, no se ha detectado Salmonella en ninguno de ellos. (12)

Otro estudio realizado en 2016 en España por el Ministerio de Agricultura Pesca y Alimentación indica que se muestrearon aves sometidas a rigurosos controles, con resultados de prevalencia de Salmonella inferiores al 1%, exceptuando las gallinas ponedoras con 1.59%. (6)

No hemos encontrado estudios similares en el norte de España para identificar Salmonella spp. en los huevos puestos por gallinas criadas en libertad. En este estudio nos propusimos investigar la presencia de Salmonella spp. en huevos caseros recogidos en granjas de las provincias de Asturias y León que no han pasado ningún control sanitario antes de ser destinados al consumo.

Material y métodos
Para la toma de muestras utilizamos medio XLD de la casa Labkem, adquirido como medio deshidratado y preparado adaptando las instrucciones del fabricante a nuestras necesidades. Para nuestro estudio hemos modificado la cantidad de agua destilada, aumentando 2.5 veces la cantidad indicada. De esta forma se ha conseguido una consistencia semifluida.

Los hisopos para la toma de muestras y transporte los preparamos de la siguiente forma: a los hisopos estériles en tubo les añadimos, de forma aséptica, 3 ml del medio preparado según se ha descrito anteriormente y los conservamos en nevera a 4ºC hasta su uso.

Para el aislamiento utilizamos medio Hektoen de la casa Cultimed adquirido como medio deshidratado, y lo preparamos en el laboratorio respetando las instrucciones del fabricante. Las placas Petri con el medio se conservaron en nevera a 4ºC hasta su uso.

Estos dos medios de cultivo utilizados, XLD y Hektoen son selectivos y enriquecidos para aislamiento de Salmonella spp.

La identificación definitiva se realizó empleando el sistema API de Biomerieux (galerías API 20E) e interpretando los resultados mediante el software Identax sobre las bases de datos de perfiles bacterianos de API 20E.

El criterio usado para confirmar o descartar la posible presencia de Salmonella spp. ha sido la capacidad para reducir sulfito a H2S. La posible presencia de la bacteria se visualiza como colonias negras o con centro de color negro.

El aislamiento e identificación solamente se ha realizado a las muestras que por esta reacción han mostrado la aparición de precipitado negro.

Hemos tenido en cuenta que la característica de sulfito reductora, además de la Salmonella spp., la tienen también otros bacilos Gram negativos como Citrobacter spp. una bacteria intestinal. (13)

La toma de muestras la realizamos en 9 localidades con casas particulares o pequeñas granjas en pueblos de Asturias y León. Hemos intentado que el número de huevos por cada granja fuera de 30 unidades, por ser considerado un tamaño muestral significativo, de forma que en conjunto proporcionarían una visión general objetiva de la situación real en la zona norte de España. En el caso de que no hubiese tantas unidades disponibles el estudio lo realizamos igualmente con el número total de los existentes en ese momento.

La toma de muestras la realizamos en el propio lugar de producción con guantes. Se pasó el hisopo, preparado al efecto, varias veces por toda la superficie del huevo, en trazos longitudinales y a continuación lo introdujimos en el tubo con medio XLD de enriquecimiento.

Muestreamos un total de 186 huevos de 8 puntos de Asturias (166 unidades) y 1 punto de León (20 unidades), de granjas particulares, tomando las muestras in situ. El estudio lo realizamos desde el 10/11/2018 hasta el 03/02/2019, procesándolas en el Laboratorio de Microbiología del Instituto Isla de la Deva en Piedras Blancas, Asturias.

La siguiente tabla indica los resultados obtenidos en las muestras procesadas:Localidad de la toma de muestras.

  1. Número de huevos muestreado.
  2. Resultados sulfhídrico positivo (H2S) obtenidos en el tubo de enriquecimiento.
  3. Resultados sulfhídrico positivo (H2S) obtenidos en placa Petri tras aislamiento.
  4. Número de tinciones de Gram en las que se han confirmado bacilos Gram negativos.
  5. Número de galerías API20E realizadas para la identificación del microorganismo aislado.
  6. Número de resultados positivos para Salmonella spp.

De 186 huevos, tras la toma de muestras y respectiva incubación, 20 muestras han dado reacción sulfhídrico positiva. Hemos sembrado estas muestras en placa Petri con medio Hektoen para aislar estas colonias sulfhídricas positivas.

Tras la realización de API 20E no detectamos la presencia de Salmonella spp. en ninguna de las muestras analizadas, lo que nos indica que la presencia de la bacteria es insignificante e indetectable por nuestro método.

La identificación final descarta presencia de Salmonella, pero confirma la presencia de Citrobacter spp., bacteria intestinal.

A los propietarios de las granjas se les realizó una encuesta en el momento de la toma de muestras. Los resultados son los siguientes:

  • Ante la pregunta de la procedencia de las ponedoras, el 100% de los propietarios afirma comprarlas en cooperativas avícolas de la zona. Generalmente son adquiridas con 18-22 semanas de edad, que es cuando alcanzan la madurez. Según alcanzan la vejez (60 semanas) las van reemplazando por gallinas jóvenes.
  • Ante la pregunta si los huevos se recogen de los nidos en el día de puesta, la respuesta general, el 90%, es positiva.
  • Ante la pregunta de si vacunan ellos las gallinas la respuesta es negativa en el 100% de los casos.
  • Ante la pregunta de cómo almacenan los huevos recogidos, el 100% afirman refrigerarlos.

Discusión
Según la investigación bibliográfica realizada, la normativa de Sanidad en cuanto a las vacunas contra Salmonella spp. es obligatoria en las cooperativas avícolas. En nuestro país, aunque en la propia granja no haya control sanitario específico para ponedoras, al existir la vacunación previa obligatoria contra Salmonella spp. en pollos destinados a la crianza para carne y huevos, podemos afirmar, según nuestros resultados, que cumple con lo esperado de inmunizar a la ponedora contra cepas que afectan a humanos.

Otro factor que posiblemente frene el crecimiento de las colonias de Salmonella spp. es la temperatura. Estudiando la bibliografía disponible, podemos afirmar que en los huevos almacenados a bajas temperaturas se reduce drásticamente la proliferación de la bacteria. Si la bacteria está presente, es difícil que se pueda multiplicar, quedando en un estado de letargo no reproducible siempre y cuando los huevos sean refrigerados a menos de 10ºC y con poca humedad. Si hubiese alguna unidad de Salmonella spp. que pudiese proliferar, resultaría imposible su aislamiento en cultivo al estar inhibida por el crecimiento de las demás bacterias intestinales.

Llevamos a cabo nuestro estudio en los meses de invierno, con temperaturas que no han superado los 15ºC, y en refrigeración, lo que ha influido en el resultado nulo de Salmonella spp. aislada en cáscara, ya que no ha existido el riesgo de que los huevos quedaran expuestos a temperaturas cálidas, propicias para el crecimiento bacteriano desde la ovoposición hasta su recogida del nido.

Nuestro estudio confirma los datos que tenemos disponibles en cuanto la prevalencia de Salmonella en huevos de gallina en nuestro país. Es posible que los métodos microbiológicos tradicionales usados no sean muy sensibles, ni muy específicos, por lo tanto, se necesitaría implementar métodos más fiables de detección a través de técnicas de biología molecular, por PCR o técnicas inmunológicas.

Es necesario realizar más estudios, con mayor amplitud geográfica y realizarlos en los meses de verano cuando la temperatura es más propicia para la proliferación bacteriana.

También se requieren otros estudios más completos por parte de las autoridades sanitarias para identificar otras bacterias intestinales con posibilidades de hacer enfermar al consumidor de huevos de granja.

Conclusiones
La conclusión a la que llegamos a través del presente estudio es que el consumo de este este tipo de huevos es seguro en cuanto la presencia de Salmonella spp. ya que el patógeno no ha sido aislado en nuestras muestras.

Por otro lado, no podemos afirmar la inocuidad total para otro tipo de patógenos del huevo de granja, porque hemos identificado otras bacterias intestinales de la familia Enterobacteriaceae, del grupo de los Coliformes como Citrobacter spp., que, aunque habitualmente son bacterias saprofitas, pueden causar gastroenteritis en pacientes en situación de riesgo.

Podemos afirmar que el programa de vacunación y control sanitario de las aves contra la Salmonella está funcionando, se está demostrando la inmunidad contra las dos cepas S. enteriditis y S. typhimurium asegurando al consumidor un producto libre de este patógeno.

Por otro lado, reducir al máximo el posible grado de contaminación por Salmonella spp. o de cualquier organismo patógeno del huevo presente tanto en cáscara como en interior, se puede lograr usando medidas preventivas básicas de manipulación e higiene. La adquisición de productos con garantías, una buena manipulación de los mismos, siempre refrigerados, evitar el uso de huevos agrietados o sucios, y utilizar tiempos de cocción largos, con altas temperaturas, aseguran la destrucción de los patógenos y reducen al máximo la probabilidad de infección con Salmonella spp.

Bibliografía

  1. LARA VILLEGAS HH, AYALA NÚÑEZ NV, RODRÍGUEZ PADILLA C. Laboratorios de bioseguridad nivel 3 y 4: Investigación de patógenos peligrosos. Patol. Clin. 2007 Octubre- Diciembre; 54(1, pp 177-186).
  2. MOGOLLÓN D., M VZ, RODRÍGUEZ VE, M. VZ, VERJÁN, D. P. Prevalencia y factores de riesgo para la contaminación por Salmonella spp en huevos comercializados en Ibagué, Colombia. Revista Colombiana de Ciencia Animal. 2015; 8(1).
  3. Revista del Comité Científico de AESAN. Establecimiento de un criterio microbiológico para Salmonella en huevos destinados al consumo directo. Informe. Madrid: AESAN; 2007-2008. Report No.: 7.
  4. GONZÁLEZ PEDRAZA J, PEREIRA SANANDRES N, SOTO VARELA Z, HERNÁNDEZ AGUIRRE E, VILLAREAL CJ. Aislamiento microbiológico de Salmonella spp. y herramientas moleculares para su detección. Salud Uninorte. 2014 enero- abril; 30(2).
  5. GUTIÉRREZ CASTILLO ADC, PAASCCH MARTÌNEZ H, CALDERÓN APODACA L. Salmonelosis y campilobacteriosis, las zoonosis emergentes de mayor expansión en el mundo. Veterinaria México. 2008 enero-marzo; 39(1).
  6. Ministerio de Agricultura y Pesca, Alimentación y Medio Ambiente. Informe de zoonosis y resistencias antimicrobianas. Madrid: Gobierno de España; 2016.
  7. PARRA, DURANGO J, SALÍM M. Microbiología, patogénesis, epidemiología, clínica y diagnóstico de las infecciones producidas por Salmonella. MVZ Córdoba. 2002; 7(2, 187-200).
  8. Immerseel PFV. Inmunidad que confieren en pollos las vacunas con cepas vivas de Salmonella y su modo de acción. AviNews Avicultura. 2018 noviembre;(26).
  9. Centro Nacional de Epidemiología. Brotes de enfermedades transmitidas por alimentos España, 2004-2007(excluye brotes hídricos). Boletín Epidemiológico semanal. 2008 23/11-29/11; 16(21/241-252).
  10. SÁNCHEZ MORA J. Determinación de la prevalencia de enterobacterias del género Salmonella spp. en huevos frescos de gallina de empresas avícolas de la provincia de Tungurahua. Trabajo Grado. Quito: Universidad Central de Ecuador, Medicina Veterinaria y Zootecnia; 2013.
  11. RAMÍREZ Y, RINCÓN DP, VARGAS M. C. Salmonella entriditis en huevos de gallina comercializados en Tunja (Colombia). Salud Soc. Uptc. 2014 Noviembre; 1(2).
  12. European Food Safety Authority. Trends and sources of zoonoses and zoonotic agents in foodstuffs, animals and feedingstuffs. annual national report. Spain: Zoonoses Monitoring; 2016.
  13. LOPARDO Á, PREDARI S, VAY C. Salmonella, Edwardsiella, Citrobacter. In Horacio A. Lopardo SCPCV, editor. Manual de microbiología de la Asociación Argentina de Microbiología. Ciudad Autónoma de Buenos Aires: Libro digital, PDF; 2016. p. 231-235.