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octubre 2020

Comparación in vitro del poder antibacteriano de mieles de la provincia Granma frente a Escherichia coli.

Vet. Arg. – Vol.  XXXVII –  Nº 390–  Octubre 2020.
Alcíbiades Ojeda Rodríguez1,2; Armando Escalona Rosabal1; Carlos Olmo González1; Omar Moreno Sánchez1; Viviana López Saumell1; Yeny de la Caridad Tamayo Moreno1; Osmaida Estrada Cutiño1.

Resumen
Con el objetivo de comparar la actividad antibacteriana que poseen las mieles de la provincia de Granma frente a la Escherichia coli ATCC25922 para la contribución de conocimientos sobre las propiedades medicinales de las mieles de abejas Apis mellifera. El trabajo lo conforman las mieles poliflorales de Apis mellifera procedentes de apiarios de productores de los municipios de Guisa y Bartolomé Masó, provincia Granma y perteneciente a la empresa APICUBA, Cuba. Se tomaron muestras de la miel de colmenas de 10 apiarios de cada municipio. Para un total de 20 muestras, Guisa (10) y Bartolomé Masó (10). El análisis se realizó en el Laboratorio Microbiológico, Departamento de Medicina Veterinaria y Zootecnia, Universidad de Granma, Cuba. Se realizaron 3 procedimientos: 1. Determinación de inhibición del crecimiento. 2. Determinación de Concentración Inhibitoria Mínima (CIM). 3. Verificación de la metodología (Determinación de los halos de inhibición). Análisis estadísticos: se realizó el análisis de varianza simple (ANOVA) empleando el paquete estadístico INFOSTAT (2001) versión 1. De acuerdo a los análisis realizados a las mieles poliflorales de Apis mellifera de la provincia de Granma, Cuba, se concluye que esta posee poder antibacteriano frente a la E. coli, los mejores resultados se encontraron en el municipio de Guisa las cuales son efectivas hasta un 30% con respecto al municipio Bartolomé Masó (50%) sin mostrar diferencia significativa en la sensibilidad (halos de inhibición 17 y 14 mm) respectivamente.
Palabras clave: miel de abeja, efecto antibacteriano, E. coli.

Comparison in vitro of antibacterial power of honeys of Granma province in front of Escherichia coli.
Summary
With objective of comparing the antibacterial activity that the honeys of Granma province possess in front of Escherichia coli ATCC25922 for the contribution of knowledge about the medicinal properties of the honeys of bees Apis mellifera. The work conforms it the honeys multiflowers of Apis mellifera coming from apiarios of producing of the municipalities of Guisa and Bartolomé Masó, Granma province and belonging to company APICUBA, Cuba. It took samples of the honey of beehives of 10 apiarios of each municipality for a total of 20 samples, Guisa (10) and Bartolomé Masó (10). The analysis was carried out in the Microbiologic Laboratory, Department of Veterinary Medicine and Zootechny, University of Granma, Cuba. It was carried out 3 procedures: 1. Determination of inhibition of the growth. 2. Determination of Minimum Inhibitory Concentration (CIM). 3. Verification of the methodology (Determination of the inhibition halos). Statistical Analysis: it was carried out the analysis of simple variance (ANOVA) using the statistical package INFOSTAT (2001) version 1. According to the analyses carried out to the honeys multiflowers of Apis mellifera of Granma province, Cuba, it concludes that this possesses antibacterial effect in front of E. coli, the best results were in the municipality of Guisa which are effective until 30% with regard to the municipality Bartolomé Masó (50%) without showing significant difference in the sensibility (inhibition halos 17 and 14 mm) respectively.
Key words: bee honey, antibacterial effect, E. coli.
1-Universidad de Granma, Cuba.
2-E-mail: aojedar@udg.co.cu

Introducción
El uso indebido e indiscriminado de los antibióticos en las últimas décadas, para profilaxis y tratamiento de enfermedades tanto en el hombre como en los animales, ha detonado una alarma en el mundo de la medicina microbiológica, ya que los microorganismos han respondido de una manera peligrosa, con la llamada resistencia bacteriana, por eso es necesario reconocer, investigar y aplicar en nuestro campo profesional, las opciones alternas que existen en el campo de la medicina (Romeros y Gómez, 2013).

La miel es la sustancia azucarada elaborada a partir del néctar de las flores por la abeja obrera. Es el más antiguo de los alimentos azucarados conocidos por el hombre. Es un alimento energético y un tratamiento eficaz contra muchas enfermedades y dolencias. La acción positiva que ejerce sobre el organismo se debe a sus componentes, como los azúcares, oligoelementos orgánicos y minerales, las hormonas y las vitaminas, sustancias vivas que desempeñan un papel de poderosos catalizadores, capaces de liberar la energía contenida en potencia en otros elementos.

Específicamente a la miel se le han reconocido propiedades medicinales desde la antigüedad: como tratamiento terapéutico contra infecciones causadas por bacterias y hongos, en heridas abiertas, ulceras, quemaduras e infecciones oculares. Diferentes autores han reconocido que sus características antibacteriales de la miel se deben en parte a su osmolaridad relacionada con su contenido de agua, su bajo pH, la presencia de peróxido de hidrógeno y algunos componentes fitoquímicos específicos de las diferentes clases de plantas, las cuales le transfieren sus cualidades al néctar recolectado por la abeja (Romeros y Gómez, 2013).

Actualmente en las bacterias existen incrementos de los diferentes mecanismos de resistencia, inhibiendo el poder bactericida de algunos antibióticos comúnmente utilizados. Es por esa razón que el uso de la medicina alternativa ha aumentado en respuesta a esta necesidad (García, 1961).

Entre las bacterias que tienen importancia significativa está Escherichia coli, la que se relaciona a diferentes patologías, estando entre las más importantes: infección urinaria, neumonía, meningitis en los neonatos y choque inducido por endotoxinas. Esta bacteria presenta resistencia a la mayoría de antibióticos de uso común, como por ejemplo ampicilina, trimetoprim sulfametoxasole y tetraciclina, siendo susceptible a antibióticos de amplio espectro (Koneman, 1999).

Debido a esta resistencia que presenta Escherichia coli y otras bacterias, en varias partes del mundo se considera el uso de alternativas medicinales, consistentes en componentes 100% naturales; un ejemplo de éstos es la miel de abeja, ya que ha presentado actividad bactericida en estudios anteriores contra Staphylococcus aureus meticilino resistente, Pseudomona aeruginosa, Klebsiella spp. y Helicobacter pylori (Journal of Applied Microbiology, 2002).

La miel de abeja tiene un precio asequible lo cual lo hace accesible para las poblaciones de bajos recursos y además contiene componentes tales como carbohidratos, flavonoides, vitaminas, peróxido de hidrogeno, etc. Uno de los componentes, el metil-glioxal, se considera altamente citotóxico bacteriano que podría ser de utilidad para posibles tratamientos alternativos o en conjunto con otras drogas.

Sobre la base de este conocimiento se planteó la presente investigación con el objetivo de comparar la actividad antibacteriana que poseen las mieles de la provincia de Granma frente a la Escherichia coli ATCC25922 para la contribución de conocimientos sobre las propiedades medicinales de las mieles de abejas Apis mellifera.

Materiales y Métodos
El trabajo lo conforman las mieles poliflorales de Apis mellifera procedentes de apiarios de productores de los municipios de Guisa y Bartolomé Masó, provincia Granma y perteneciente a la empresa APICUBA, Cuba. Se tomaron muestras de la miel de colmenas de 10 apiarios de cada municipio. Para un total de 20 muestras, Guisa (10) y Bartolomé Masó (10). El análisis se realizó en el Laboratorio Microbiológico, Departamento de Medicina Veterinaria y Zootecnia, Universidad de Granma, Cuba.

Materiales utilizados durante la investigación:

-Reactivos: Agua destilada, Agar y Caldo Müeller Hinton,  Agar MacConkey.

-Materiales y cristalería: batas, 1 caja guantes, Algodón, Marcador, Asas de inoculación, Espátulas, Fósforos, cajas de Petri, tubos de ensayo, probeta graduada, Erlenmeyer de 500 ml.

-Equipos: Autoclave (marca Castle Sterilizer), Balanza analítica (marca Denver Instrument XE-310), Campana de flujo laminar (marca Labconco tipo II biosegurity), Estufa, Incubadora a 37°C ± 1ºC (marca precision mechanical), Refrigeradora (marca Haler), Baño de María a 44 ºC ± 0.5.

Procedimientos

  1. Determinación de inhibición del crecimiento
  2. Para evaluar la efectividad de la miel para inhibir el crecimiento bacteriano, se realizó un tamizaje preliminar, consistente en la preparación de tubos que contenían 1 ml de Caldo Müeller-Hinton, elaborado según instrucciones del fabricante, luego se inoculó una asada de la bacteria Escherichia coli ATCC25922, incubándola por 24 horas a 35 0C.
  3. Para comprobar el crecimiento bacteriano en el caldo del inciso anterior, se sembró una asada del caldo en agar MacConkey incubando por 24 horas a 35 0C, como control de calidad del crecimiento de la bacteria en el caldo.
  4. Al comprobar el crecimiento bacteriano en los tubos, se les agregó 9 ml de miel de cada apiario a tubos por separado, obteniendo miel diluida al 90 % (dilución 9:10).
  5. Los tubos se incubaron a 35 0C y 42 0C por 48 horas, para que la miel expresara su acción inhibitoria.
  6. La identificación de esta actividad se realizó sembrando una asada del caldo en agar MacConkey, dejándolo incubar por 24 horas a 35 0C para identificar crecimiento o inhibición, según el inciso b.
  7. Este procedimiento se realizó por cada miel 2 veces.

Los resultados se interpretaron según Perdomo (1999), de acuerdo al crecimiento a lo largo del inóculo en la placa: -Actividad negativa: si hubo crecimiento homogéneo a lo largo el inóculo (no hay inhibición). -Actividad positiva: no hubo crecimiento homogéneo a lo largo del inóculo (hay inhibición), se procede como en el Paso 2. -Contaminación: Presencia de microorganismos fuera del inóculo.

  1. Determinación de Concentración Inhibitoria Mínima (CIM).
  2. Si en el Paso 1 existe inhibición, se procede a la determinación de la Concentración Inhibitoria Mínima (CIM), previamente se preparan tubos con Caldo Müeller-Hinton (según instrucciones del fabricante) con un volumen de miel a la concentración como se explica en el inciso b, de estos medios se incubaron 4 tubos a 35 0C por 24 horas para comprobar esterilidad de los medios preparados.
  3. Diluciones (v/v) realizadas a las mieles:

15.0 ml de Caldo Müeller-Hinton +   5.0 ml de miel abeja = 25 % miel (1:4)

10.0 ml de Caldo Müeller-Hinton + 10.0 ml de miel abeja = 50 % miel (1:2)

5.0 ml de Caldo Müeller-Hinton + 15.0 ml de miel abeja = 75 % miel (3:4)

  1. Se les inoculó a los tubos con las diferentes concentraciones una asada de la bacteria Escherichia coli ATCC25922, incubándolos por 24 horas a 35 0C.
  2. Para demostrar la ausencia de crecimiento se dio pase de los tubos a placas con Agar Mac Conkey, realizándole tres estrías de forma paralela y se incubaron a 35°C por 24 horas.

Al observar crecimiento entre estas concentraciones, se realizaron diluciones intermedias para poder determinar la concentración mínima a la cual la miel impide el crecimiento bacteriano.

  1. Se realizaron las lecturas e interpretación según el Paso 1.
  2. El resultado se reportó según la concentración a la que se encontraba la miel en el medio.
  3. Verificación de la metodología (Determinación de los halos de inhibición).
  4. Después de haber determinado la CIM de la miel, para verificar la metodología y compararla con resultados realizados en otros países, se impregnaron discos de papel filtro con la concentración de la miel que se obtuvo en el paso anterior (Paso 2), según el procedimiento de Kirby-Bauer (1996).
  5. Seguidamente, en un tubo de ensayo estéril con 3 mL de solución salina de 0.9 % se le agrego colonias de un cultivo fresco de la cepa de Escherichia coli ATCC25922 (crecimiento de toda la noche en agar MacConkey a 37 ºC) y se llevó a una turbidez de 0.5 de la escala de MacFarland bajo condiciones estériles (Perilla et al., 2004), con un hisopo estéril, se inoculó en el medio Müeller-Hinton estriándolo en tres direcciones y colocando sobre este los discos de papel filtro impregnados con miel, posteriormente se incubaron las cajas por 24 horas a 35ºC.
  6. El resultado se reportó según el diámetro del halo presentado.

Para comparar el crecimiento de la E. coli se utilizó como Control positivo: Discos de sensibilidad con el antibiótico Gentamicina (10 μg) y Amoxicilina (30 μg), para inhibir el crecimiento de E. coli ATCC25922 (0 % de crecimiento) y Control negativo: Agar sin componentes adicionales (100 % de crecimiento).

Se utilizará como medida los diámetros de estas zonas en mm, según la escala de Duraffourd et al. (1987).

 Nula (-) para un diámetro inferior a 8 mm.

 Sensibilidad límite (sensible = +) para un diámetro comprendido entre 8 a 14 mm.

 Medio (muy sensible = ++) para un diámetro entre 14 y 20 mm.

 Sumamente sensible (+++) para un diámetro superior a 20 mm.

Análisis estadísticos. Para la comparación de los datos se empleó el análisis de varianza simple (ANOVA). Previamente se realizó prueba de Kolmogorov-Smirnov y la prueba de Barttlet para probar la normalidad de los datos y la homogeneidad de varianza entre tratamientos respectivamente. Se utilizó el paquete estadístico INFOSTAT (2001) versión 1.

Resultados y Discusión
Para evaluar el poder antibacteriano que posee la miel de dos municipios de la provincia de Granma (Guisa y Bartolomé Masó) frente a Escherichia coli, dentro de la investigación se realizó un tamizaje inicial para comprobar la acción que ejerce frente a la bacteria en estudio.

De las mieles analizadas en el tamizaje preliminar, se observó que todas las muestras de las mieles al 90% de los apiarios de Guisa y Bartolomé Masó presentaron actividad bactericida frente a Escherichia coli ATCC25922 (dilución 9:10), no hubo crecimiento en la placa de agar Mac Conkey. Es importante hacer notar que en la práctica del tamizaje no se encontró diferencias entre los resultados de los análisis incubados a 37°C y 42°C obteniéndose inhibición completa en las dos repeticiones realizadas para cada una de las muestras.

Este efecto antibacteriano de la miel coincide con lo reportado por Becerra et al. (2016), quienes aplicaron miel de abeja a 6 cultivos de Staphylococcus aureus en caldo nutritivo en concentraciones de 30%, 60% y 100%, incubaron por 24 horas, luego observaron el efecto antibacteriano a través de un cultivo en agar sangre en otras 24 hrs. Comprobaron que la actividad bactericida de la miel frente a S. aureus es muy efectiva, concluyen que la miel de abeja a mayor concentración produce mayor efecto antibacteriano sobre S. aureus.

En un estudio realizado en el estado Trujillo por Aguilera et al. (2009), indican que la miel de abejas procedente de dicho estado inhibe el crecimiento bacteriano de S. aureus, tanto en el disco impregnado con la miel concentrada como en la diluida 1:2, lo cual indica que la miel debe utilizarse de manera concentrada, o en su defecto poco diluida para que pueda ejercer su acción antimicrobiana.

Gamboa y Figueroa (2009), mediante pruebas in vitro determinaron la capacidad antibacteriana, de 37 mieles de la especie Tetragonisca angustula de siete regiones de Colombia, con la técnica de Concentración Mínima Inhibitoria (CMI) frente a tres especies de bacterias Gram positivas Bacillus subtilis; Staphylococcus aureus; Micrococcus luteus y tres Gram negativas Salmonella entérica sp. enterica serovar Typhimurium; Escherichia coli y Klebsiella pneumoniae sp. La técnica CMI se evaluó en microdiluciones (v/v) al 90%, 45%, 22,5%, 12,3%, 5,6% de miel. Concluyeron que las mieles presentaron efecto bactericida contra todas las cepas bacterianas del ensayo con mayor efectividad para E. coli, M. luteus y S. entérica, con una probabilidad de p(x)=1 a una dilución de 90%; al ser diluidas el mayor efecto se evidenció frente a M. luteus donde aún en dilución 5,6% presentaban probabilidades de p(x)=0,62 de actividad inhibitoria por parte de las mieles.

Como todas las muestras resultaron ser positivas se procedió a determinar la Concentración Inhibitoria Mínima (CIM), obteniendo como resultado que las mieles del municipio Guisa poseen actividad para Escherichia coli a una concentración de 30% y las procedentes de los apiarios de Bartolomé Masó presenta actividad antibacteriana a una concentración de 50% marcando diferencia altamente significativa (P<0.05) como se observa en la Tabla 1.

Tabla 1. Concentración inhibitoria mínima (CIM) de las mieles.

(a, b,) Letras diferentes en la misma columna difieren significativamente (P<0.05)

Autores como Basson y Grobler (2008) al evaluar las propiedades antibacterianas de las mieles de  Bluegum, Fynbos, Pincushion y Manuka contra la E. coli encontraron un promedio de 25% de Concentración Inhibitoria Mínima (CIM) para todas. También Tan et al. (2009), encontraron efecto antibacteriano en mieles de Tualang a una concentración de un 22.5% y Manuka (UMF10+) 20% frente a la E. coli. Estos resultados son similares aunque inferiores a los encontrados en esta investigación para el municipio de Guisa.Las diferencias informadas en los efectos antimicrobianos de la miel son dependientes en su origen geográfico, la fuente botánica así como tiempo y proceso de cosecha, las condiciones de almacenamiento, y la naturaleza de los patógenos probados (Sherlock et al., 2010; Al-Waili et al., 2011). La actividad antibacteriana de la miel varía dependiendo del origen floral (Salomón, 2010; Alzahrani et al., 2012).Por su parte Estrada et al. (2005) al evaluar la actividad antimicrobiana de la miel de abejas contra Staphylococcus aureus, S. epidermis, Pseudomona aeruginosa, E. coli, Salmonella enteriridis, Listeria monocytogenes y Aspergillus niger encontraron que la E. coli no fue inhibida por las concentraciones menores de 25 % (v/v) a diferencia de otras bacterias que investigaron, resultados que corroboran los de esta investigación.

En un estudio reciente, Jeddar et al. (1985), evaluó el efecto antibacteriano de miel pura in vitro. Ellos probaron que el crecimiento de bacterias en medios que contuvieron concentraciones diferentes de miel, 10%, 20%, 30%, 40%, y 50% (w/v). La mayoría de las bacterias patógenas no creció al 40% de concentración de miel y ni por encima, y el mecanismo se explicó a través de las razones siguientes: El efecto osmótico de la miel causó encogimiento y ruptura entre las células bacterianas. El bajo pH. La presencia de otras sustancias antibacterianas no identificadas en la miel.

Su poder antiséptico se debería, aparte de la alta concentración de azúcares y del poder antimicrobiano de ciertos ácidos orgánicos, a la formación de peróxido de hidrógeno a partir de glucosa por la acción del complejo enzimático glucosa-oxidasa (Subrahmanyam, 1991; Moore et al., 2001; Wijesinghe et al., 2009; Malik et al., 2010). Los autores bautizaron al principio responsable de tal efecto con el nombre de “inhibina”, aún antes de identificar que se trataba del peróxido de hidrógeno. La “inhibina” se describió como termolábil y fotosensible, de ahí que una miel excesivamente calentada o expuesta a la luz directa durante mucho tiempo pierda sus propiedades antisépticas (Moore et al., 2001).

En las mieles de abeja también existen compuestos de tipo no peroxídicos que generan actividad antibacteriana; estos varían según las especies vegetales de las que las abejas toman el néctar. La inhibición del crecimiento bacteriano por la miel ha sido demostrada utilizando discos de agar impregnados en esta sustancia frente a distintos microorganismos (Moore et al., 2001; Malik et al., 2010).

Los resultados revelaron que la actividad antimicrobiana aumentó con el volumen de agua en la miel hasta una concentración determinada por el origen de la misma Guisa (30%) y Bartolomé Masó (50%). Similares a los reportados en mieles de Nueva Zelanda dónde la actividad antibacteriana encontrada era más eficaz a las concentraciones bajas de miel (Molan y Russell, 1988). Esto asume que la actividad antimicrobiana de las mieles evaluadas en el presente estudio depende del volumen de peróxido de hidrógeno endógeno que es el agente antibacteriano principal en la miel (Morse, 1986).  De hecho, el potencial antibacteriano de peróxido de hidrógeno es el resultado de la acción de estas moléculas oxidando altamente reactivo, las cuales juegan el papel de un “agente de limpieza” que ataca la membrana celular de microorganismos produciendo radicales libres que inducen la destrucción celular.

En el Paso 3 (Verificación de la metodología) se confirmó la acción inhibitoria presentada, obteniendo halos inhibitorios en Agar Müeller-Hinton con promedio de medición de 17 mm para la miel de los apiarios del municipio de Guisa a un 30% (v/v) sin marcar diferencia significativa con el promedio de la miel del municipio de Bartolom Masó que evidenció halos de inhibición de 14 mm a un 70 % (v/v) de concentración. Se puede observar que la bacteria Escherichia coli es susceptible a las mieles de los apiarios analizados (Tabla 2).

Tabla 2. Diámetros de halos inhibitorios con discos impregnados con miel Frente a Escherichia coli.

N/S = Diferencia no significativa.

Zbuchea (2014) y Fiorilli et al. (2015), observaron en su estudio un completo efecto bactericida solamente cuando diluyeron la miel pura al medio (1:2) con caldo Müeller-Hinton, según estos autores concuerda con lo reportado en la literatura y similar al encontrado en la miel del Municipio de Bartolomé Masó (50%).

Las mieles del municipio de Guisa (30%) se explica porque probablemente, el efecto bactericida de la miel estaría dado por la producción de peróxido de hidrógeno a través de la glucosa oxidasa (Zbuchea, 2014; Cooper et al., 2002). Dicha producción dependería del grado de dilución de la miel y sería mínima cuando la miel está concentrada. Las variaciones de la concentración de la glucosa oxidasa acorde al grado de dilución de la miel, podrían explicarse por el requerimiento de agua libre para activar la enzima ya que en la miel concentrada el agua estaría unida a los hidratos de carbono y por lo tanto, no estaría disponible (Cooper et al., 2002).

Laallam et al. (2015), evaluaron la actividad antimicrobiana de 32 muestras de miel recolectada del Desierto de Sahara Argelino en cuatro bacterias; Bacillus subtilis, Clostridium perfringens, Escherichia coli, y Staphylococcus aureus. Este efecto aumentó con el incremento del agua y la reducción de los azúcares en la miel, la E. coli fue la especie más sensible con una zona de inhibición de 10.1 ± 4.7 mm, mientras el C. perfringens fue el menos sensible.

Así también Carrión (2016), evaluó in vitro el efecto antibacteriano de la miel de abeja de la Sierra y Costa Ecuatoriana ante cepas de Estreptococo mutans llegando a la conclusión que la miel de la sierra se muestra más efectiva en concentraciones al 50% y 80% con halos de inhibición de 9 mm y 12.4 mm respectivamente a diferencia de la miel de la costa que mostro efectividad solamente al 80% con halo de 9.6 mm resultados similares al nuestro.

En esta investigación se observa que la miel del municipio de Guisa tiene mayor efecto antibacteriano debido a que inhibe el crecimiento de la bacteria a una menor concentración (30%) con respecto al municipio Bartolomé Masó (50%). La diferencia de actividad antibacteriana entre estos dos municipios sugiere que la composición de la miel dependiendo de su origen indica su potencia.

Los diferentes factores antimicrobianos de la miel determinan la potencia de cada miel de abeja, la cual puede variar (Molan, 2006) dependiendo de su origen botánico, geográfico, entomológico, aplicación de Buenas Prácticas Agrícolas (BPA) Y Buenas Prácticas de Manipulación (BPM) durante su procesamiento tecnológico.

Aguilera et al. (2009) evaluaron la actividad antimicrobiana de 9 mieles venezolanas, utilizando cepas ATCC de E. coli y Staphylococcus aureus. Las mieles las utilizaron concentradas y diluidas (1:2; 1:4; 1:8). Estos observaron la inhibición del crecimiento de S. aureus en la miel del estado de Trujillo sin diluir y en su dilución 1:2, mientras que no observaron inhibición de crecimiento para la E. coli. Resultados que no coinciden con esta investigación teniendo en cuenta que si se observó la inhibición de la E. coli.

Conclusiones
De acuerdo a los análisis realizados a las mieles poliflorales de Apis mellifera de la provincia de Granma, Cuba, se concluye que esta posee poder antibacteriano frente a la E. coli, los mejores resultados se encontraron en el municipio de Guisa las cuales son efectivas hasta un 30% con respecto al municipio Bartolomé Masó (50%) sin mostrar diferencia significativa en la sensibilidad (halos de inhibición 17 y 14 mm) respectivamente.

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