keyboard_arrow_up
enero 2021

Uso de los antioxidantes en la conservación del semen de verraco.

Vet. Arg. – Vol.  XXXVIII –  Nº 393 –  Enero 2021.

Córdova Izquierdo, Alejandro1, Iglesias Reyes, Adrián, Emmanuel1,2, Juárez Mosqueda, María de Lourdes2, Guerra Liera, Juan Eulogio3, Huerta Crispín, Rubén4 y Sánchez Sánchez, Raúl5.

Resumen
La conservación de semen de verraco es una de las biotecnologías más importantes en la ganadería a nivel mundial; sin embargo, debido al manejo que sufre el semen durante este proceso, las células espermáticas entran en estado de estrés oxidativo, ocasionando daños en su estructura, disminuyendo sus características fecundantes. Para evitar este fenómeno, se han adicionando antioxidantes a los diluyentes durante la conservación seminal; nuestro equipo de trabajo del Departamento de Producción Agrícola y Animal de la Universidad autónoma Metropolitana Unidad Xochimilco en la Ciudad de México, México, está trabajando es este tema, cuyos resultados que hemos obtenido son favorables. El objetivo del presente trabajo es describir y dar importancia al uso de antioxidantes en la conservación del semen de verraco. Se describe brevemente el impacto de la porcicultura a nivel mundial, importancia de las biotecnologías reproductivas con énfasis en la conservación seminal en porcinos, se describe efecto del estrés oxidativo sobre los espermatozoides con énfasis en los de verraco y se hace una breve descripción del uso de antioxidantes como alternativa para evitar estrés oxidativo de los espermatozoides en la conservación del semen de verraco.
Palabras clave: Verraco, semen, conservación, antioxidantes.

Use of antioxidants in the conservation of boar semen
Summary
Boar semen conservation is one of the most important biotechnologies in livestock worldwide; however, due to the handling that semen undergoes during this process, the sperm cells enter a state of oxidative stress, causing damage to their structure, decreasing their fertilizing characteristics. To avoid this phenomenon, antioxidants have been added to diluents during seminal preservation; our work team from the Department of Agricultural and Animal Production of the Universidad Autónoma Metropolitana Unidad Xochimilco in Mexico City, Mexico, is working on this issue, the results of which we have obtained are favorable. The objective of this work is to describe and give importance to the use of antioxidants in the conservation of boar semen. The impact of pig farming worldwide, the importance of reproductive biotechnologies with an emphasis on seminal conservation in pigs, is briefly described, the effect of oxidative stress on sperm with emphasis on boar sperms is written, and a brief description of the use of antioxidants as an alternative to avoid oxidative stress of sperm in the conservation of boar semen.
Key words: Boar, semen, conservation, antioxidants.
1Departamento de Producción Agrícola y Animal. Universidad Autónoma Metropolitana Unidad Xochimilco, Ciudad de México, México. 2Departamento de Morfología. FMVZ-UNAM, México. 3Facultad de Agronomía. Universidad Autónoma de Sinaloa, México. 4Facultad de Veterinaria. Benemérita Universidad Autónoma de Puebla, México. 5Departaento de Reproducción. INIA, Madrid, España.
Autor de correspondencia: Dr. Alejandro Córdova Izquierdo (acordova@correo.xocuam.mx)

Introducción
La porcicultura desempeña una función importante dentro de la cadena productiva de granos y leguminosas a nivel mundial. En México es una de las principales actividades económicas del subsector pecuario y a pesar de que, en las últimas dos décadas fue mermado el crecimiento en la producción por cambios significativos en el entorno económico, el consumo de carne de cerdo en México, representa el 2.1% del total mundial, siendo una gran fuente de ingresos y generadora de empleos a nivel nacional (Iglesias et al., 2017).

Uno de los usos de la inseminación artificial (IA) en la actualidad, es para reducir la cantidad de espermatozoides que se emplean para que una hembra quede gestante. En el caso de la IA con semen de verraco fresco y refrigerado, es elevada a nivel mundial, teniendo tasas desde un 80% (comunidad europea), hasta el 50% (Estados Unidos) (Córdova et al., 2015; Córdova e Iglesias, 2016).

Mientras que la conservación e inseminación de semen de bovino es muy difundida en México; para el caso del semen de porcino, hace falta mayor difusión y en particular, el uso de la IA con semen criopreservado, en granjas comerciales porcícolas, se ha visto limitado por la dificultad en la conservación espermática por los cambios celulares que se presentan durante la manipulación del semen, afectado la viabilidad espermática de las dosis seminales. Es por ello, que distintos investigadores a nivel internacional están trabajando de forma intensiva, creando nuevos diluyentes o agregando antioxidantes como aditivos al diluyente, con el fin de mejorar las características fertilizantes del semen al momento de preservarlo en fresco, refrigerado y congelado; obteniendo resultados favorables. Sin embargo, para el caso del semen congelado de verraco, todavía no se obtienen los resultados esperados, que puedan ser aplicables a la industria porcícola y producción de cerdos para abasto (Orozco et al., 2014; Córdova et al., 2015; Williams et al., 2015; Córdova e Iglesias, 2016; Pimentel et al., 2016). El objetivo del presente trabajo fue dar a conocer el uso de antioxidantes en la conservación espermática de semen de verraco.

Conservación de semen
El éxito reproductivo es un factor clave para la rentabilidad de la industria ganadera, es por ello, que se han creado biotecnologías reproductivas, que tienen el objetivo de manejar la reproducción de los animales, teniendo gran impacto en el mejoramiento genético (García et al., 2009; Olivo et al., 2017).

Una de las biotecnologías más utilizadas a nivel mundial es la conservación o almacenamiento de semen, la cual permite mantener la fertilidad de las células espermáticas, desde el momento del eyaculado hasta la IA (Rugeles et al., 2013; Moscardini et al., 2014; Cueto et al., 2016). Sin embargo, los espermatozoides de verraco son muy sensibles al manejo del semen y los cambios bruscos de temperatura, ocasionando modificaciones estructurales que afecta la capacidad fecundante de las células espermáticas (Córdova et al., 2015b). Es por ello, que los tipos de conservación seminal se pueden dividir en 3:

Conservación en fresco: es utilizado principalmente para transportar el semen cortas distancias y empelarse inmediatamente después de su recolección, en este tipo de técnicas son utilizados principalmente los diluyentes de corta duración, manteniendo una temperatura del semen de 15-20°C (Pérez, 2008; Cuenca y Avellaneda, 2017).

Conservación en refrigeración: Es el método de almacenamiento preferido y más usado para conservar semen de verraco, para este tipo de almacenamiento son utilizados principalmente los diluyentes de mediana y larga duración, manteniendo la viabilidad seminal hasta por 6 días a una temperatura de 5°C (Moscardini, et al., 2014; Córdova et al., 2015b)

Conservación en congelación: Esta técnica permite la conservación espermática por tiempo indefinido, sin embargo, debido a la sensibilidad de los espermatozoides de verraco a las bajas temperaturas, sigue siendo investigada, ya que los resultados obtenidos al momento de la descongelación espermática, no han sido completamente alentadores, sin embargo, desde la congelación de la primera muestra seminal de cerdo en 1970, se han tenido grandes avances, alcanzando actualmente porcentajes al momento de la descongelación de hasta un 39% de motilidad (Mejía, 2010; Gallardo y Vargas, 2015; Williams et al., 2015; Alexiuo et al., 2017; Iglesias, 2019)

El estrés oxidativo en la conservación espermática
Debido a la necesidad de oxígeno en células aerobias, estas mantienen altas concentraciones de productos oxidantes, conocidos como radicales libres (RL), los cuales son moléculas con uno o más electrones desapareados en su último orbital y son capaces de reaccionar con otras moléculas, oxidándolas. Los RL son generados resultado del metabolismo celular y en buenas condiciones, ayudan a cumplir algunas funciones como la señalización celular,  sin embargo, cuando el metabolismo de las células es afectado por factores internos o externos, la producción de RL supera la capacidad antioxidante de la célula para metabolizarlas y neutralizarlas, produciendo un mecanismo que se conoce como estrés oxidativo (EO), lo que tiene un efecto tóxico en las células, afectando los componentes celulares como ADN, fosfolípidos, azúcares y proteínas (Cota, 2014; Oviedo et al., 2018; Córdova et al., 2020).

Los RL que van a reaccionar durante el EO, van a ser muy inestables, pero con un tiempo de vida muy corto, según su importancia biológica, se dividen en: Especies reactivas de oxígeno (ROS), son moléculas derivadas del oxígeno, que por medio de reacciones oxido-reducción, van a atacar constantemente organismos, dentro de este grupo se pueden encontrar el anión superóxido (O2), peróxido de hidrógeno (H2O2), radical hidroxilo (OH) e hidroperóxido (HO2); Especies reactivas de nitrógeno (ERN), los cuales van a generar daño oxidativo a compuestos de la célula, pudiendo producir la muerte celular, en este grupo se incluyen el anión peroxinitrito (ONOO), óxido nítrico (.NO) y dióxido nítrico (NO2); y los metales de transición, los cuales van a ser metales que tienen electrones desapareados pudiendo existir en forma de RL (García et al., 2012; Oviedo et al., 2018; Iglesias 2019).

De manera natural, la fuente principal de la formación de los RL es la mitocondria, en donde el oxígeno se reduce y al reaccionar con los protones, durante la cadena de transporte de electrones, forma agua; sin embargo, cuando la célula se encuentra en estrés metabólico, hay un aumento en la formación de RL, dañando la mitocondria y bloqueando la generación de energía o actuando en orgánulos y células vecinas (Cota, 2014; Samillan y Sánchez, 2017; Nuñez et al., 2018).

Al igual que lo que pasa en el resto de las células, en los espermatozoides también existe producción y presencia de RL, y en bajas concentraciones son necesarios para realizar la maduración, capacitación, reacción acrosomal, hiperactividad y fosforilación de tirosinas en los espermatozoides, sin embargo, durante el manejo, manipulación y conservación (principalmente durante la congelación) del eyaculado, ocurre un estrés a nivel celular, ocasionando que en las células espermáticas se produzca un desequilibro entre la producción de RL y los niveles antioxidantes de las células, entrando los espermatozoides en EO (Córdova et al., 2009; Williams, 2013; Córdova et al., 2020), ocasionando alteraciones celulares, pudiendo dañar ADN mitocondrial y nuclear, afectar la motilidad espermática, reacción acrosomal, capacitación y principalmente a la membrana plasmática, debido a su conformación de gran cantidad de ácidos grasos poliinsaturados (AGP), volviéndola muy susceptible al efecto de las ROS, provocando perdida de la fluidez e inhibición en la generación de ATP (Gumbao, 2015; Álvarez et al., 2017; Bin et al., 2017; Flores et al., 2018; Iglesias, 2019; Córdova et al., 2020)

Antioxidantes en la conservación de semen
Como se mencionó anteriormente, cuando las células entran en EO, se ven afectadas por los RL, por lo que las células poseen un sistema antioxidante natural, que le ayuda a reducir los niveles de RL, por lo que podemos definir a un antioxidante como cualquier sustancia que tiene la capacidad de ceder sus electrones a un RL o ROS, evitando que ataquen a macromoléculas necesarias para la función o estructura celular. Es por ello que, en los últimos años, ha ido en aumento el interés por conseguir nuevas fuentes antioxidantes naturales o sintéticas que permitan prevenir diversas patologías, conservar productos o ayudar en el beneficio de la salud (Quintanar y Calderón, 2009; Gastaldini et al., 2016, Fabricio, 2017; Iglesias, 2019).

Los antioxidantes principalmente se pueden dividir en dos tipos:

Enzimáticos: Son de producción endógena y cumplen la primera barrera frente a la producción de RL. Tienen la particularidad de que al actuar en sinergia con cofactores como son metales (cobre, magnesio, zinc o selenio) y reacciona a los RL, no se consumen. Dentro de los más importantes se encuentran la catalasa, el superóxido dismutasa y el glutatión peroxidasa (Estrada et al, 2017; García, 2018; Nuñez et al., 2018).

No enzimáticos: Son moléculas liposolubles y a diferencia de los antioxidantes enzimáticos, estos antioxidantes se consumen al reaccionar con los RL, por lo que es necesario sustituirlos. Provienen principalmente de la dieta y algunos de estos antioxidantes que se pueden mencionar están la vitaminas E, C, betacarotenos, retinol, ácido úrico, albumina, carnitina, taurina, transferrina, polifenoides, selenio, flavonoides y oligoelementos (Gumbao, 2015; Estrada et al, 2017; Nuñez et al., 2018).

Los espermatozoides también poseen un sistema antioxidante enzimático y no enzimático, como son superóxido dismutasa, catalasa y la dupla glutatión peroxidasa/reductasa, que controlan la cantidad de RL producidos y protegiéndolo del ataque de los ROS y RNS, sin embargo, estos antioxidantes se encuentran principalmente en el citoplasma de la pieza media del espermatozoide, lejos de otras regiones sensibles en la célula, como es la membrana plasmática de la cabeza y cola, núcleo y membrana nuclear, por lo que estas enzimas no le son suficientes para protegerse de los efectos del EO. Es por ello que, en la actualidad los antioxidantes se han convertido en una opción para minorizar los efectos del EO en los espermatozoides (principalmente los espermatozoides de verraco) y en la investigación se han añadido como aditivos en los diluyentes espermáticos, aumentando su duración y mejorando el desempeño reproductivo de los espermatozoides. Dentro de los antioxidantes que se han utilizado se pueden mencionar: el glutatión, vitamina E, trolox y vitamina C, obteniendo resultados positivos en la motilidad, viabilidad e integridad acrosomal, de los espermatozoides, además de aumentar el tiempo de conservación y mejorar su desempeño a la hora de inseminar a las hembras (Gumbao, 2015; Córdova et al., 2017; Kijpooncharoen et al., 2017; Yeste et al., 2017; Larbi et al., 2018; Restrepo y Rojano, 2018; Córdova et al., 2020).

Conclusiones
Los antioxidantes son una alternativa para evitar el EO en los espermatozoides en general y en particular los de cerdo. Es necesario continuar con protocolos de investigación con el fin de incluir antioxidantes en los diluyentes en la conservación del semen en general de cualquier especie de mamíferos y en particular de especies productivas como el cerdo, con el fin de mejorar las características fecundantes de los espermatozoides después de la conservación seminal y de esta manera disponer de excelente material germinal en todo momento en cualquier parte del mundo.

Bibliografía
Alexiuo Vasiliki, Basioura Athina G., Tsousis Georgius, Tzika Eleni D., Bosco Constantin M., Vatzias Georgios y Tsakmakidis Ioannis A. 2017. The effect of dilution temperature by two extenders with different specifications on boar semen quality. Veterinarski Arhiv 87 (2): 197-208.
Álvarez Rodríguez M., Vicente Carrillo A y Rodríguez Martínez H. 2017. Exogenous individual lecthin-phospholipids (Phosphatidylchoine and Phosphatidylglycerol) cannot prevent the oxidative stress imposed by criopreservation of boar sperm. Journal of Veterinary Medicine and Surgery 1 (2): 1-11.
Córdova Izquierdo A., Pérez Gutiérrez J.F., Méndez Hernández W., Villa Mancera A.E. y Huerta Crispín A.E. 2015. Obtención evaluación y manipulación del semen de verraco en una unidad de producción mexicana. Revista Veterinaria 26 (1): 69-74.
Bin He, Huiduo Guo, Yabin Gong, Ruqian Zhao. 2017. Lopopolysaccharide-induced mitochondrial dysfuntion in boar sperm is mediated by activation of oxidative phosphorylation. Theriogenology 87: 1-8.
Córdova IA, LC Ruiz, JC Córdova, JM Córdova, LJ Guerra, D Rodríguez, SK Arancibia. 2009. Estrés oxidativo y antioxidantes en la conservación espermática. Revista Complutense de Ciencias Veterinarias 3: 1-38.
Córdova Izquierdo A., Iglesias Reyes A.E., Guerra Liera J.E., De Lourdes Juárez Ma., Villa Manera A.E., Méndez Mendoza M., Huerta Crispín R., Olivares Pérez J. y Sánchez Aparicio P. 2015. Uso de Antioxidantes en la conservación de semen de cerdo. Avances en tecnología porcina 12 (11): 33-40.
Córdova Izquierdo Alejando, Iglesias Reyes Adrian Emmanuel, Espinosa Cervantes Román, Guerra Liera Juan Eulogio, Villa Mancera Abel Edmundo, Huerta Crispín Rubén, Juárez Mosqueda María de Lourdes, Méndez Hernández William, Sánchez Aparicio Pedro y Rodríguez Denis Blanca Estela. 2017. Effect of addition of antioxidants in the extender to freeze boar in two types of straws on sperm quality. International Journal of Recent Scientific Research 8 (6): 17466-17468.
Córdova Izquierdo Alejandro e Iglesias Reyes Adrian Emmanuel. 2016. Uso de antioxidantes en la ganadería. Ganadero 16 (4): 164-173.
Córdova Izquierdo Alejandro, Iglesias Reyes Adrian Emmanuel Juárez Mosqueda María de Lourdes, Guerra Liera Juan Eulogio, Huerta Crispín Rubén, Villa Mancera Abel E., Sánchez Aparicio Pedro, Gómez Vázquez Armando y Sánchez Raúl. 2020. Effect of oxidative stress on sperm cells. International Journal of Current Research 12 (04): 10021-10026.
Cota Magaña Ana Isabel. 2014. Actividad de las enzimas antioxidantes: superóxido dismutasa, catalasa y glutatión peroxidasa, en el espermatozoide y líquido seminal de conejo nueva Zelanda y su relación con el sobrepeso. Tesis para obtener el grado de Maestra en Biología de la Reproducción Animal. Universidad Autónoma Metropolitana Unidad Iztapalapa. 1-71.
Cuenca Condoy Mercy y Avallaneda Ceballos Juan. 2017. Diluyentes utilizados en inseminación artificial porcina. Revista Electrónica de Veterinaria 18 (9): 1-11.
Cueto Marcela, Gibbos Alejandro, Bruno Galarra María Macarena y Fernández Jimena. 2016. Manual de obtención, procesamiento y conservación del semen ovino. Segunda edición. Editoial INTA. Argentina.
Estrada Díaz Sylvia Adriana, Hernández Cruz Germán, Cruz Castruita Rosa María, Zavala Flores Laura Mireya, Rodríguez Bies Elizabet y Rangel Colmenero Blanca Rocío. 2017. Estrés oxidativo y capacidad antioxidante en deportistas con dieta rica en antioxidantes con zarzamora (Rubus sp.). Revista de Psicología del Deporte 26 (2): 173-179.
Fabricio Tarifa Marcos. 2017. Antioxidantes naturales como aditivos alternativos en alimento de pollo parrillero: Impacto sobre el crecimiento y el desarrollo. Tesina para optar por el título de Biólogo. Universidad Nacional de Córdoba. Facultas de Ciencias Exactas, Físicas y Naturales Carrera de Ciencias Biológicas. 1-50.
Flores C., Meléndez C., Mendoza C., Márquez Y. y Vilanova L.T. 2018. Efecto antioxidante de la melatonina durante la conservación de semen de cerdo. Revista Veterinaria 29 (1): 13-17.
Gallardo Bustillos José Oswaldo y Vargas Sandoval César Andrés. 2015. Evaluacion de tres diluyentes para criopreservar semen bovino de toros cruce Sahiwal (Bos Taurus) En el trópico Húmedo. Tesis previa a la obtención del título de Ingeniero Agropecuario. Universidad de las Fuerzas Armadas. Departamento de Ciencias de la Vida y la Agricultura. 1-89.
García Rodríguez Anaís. 2018. Estudio de nuevos marcadores de infertilidad masculina. Tesis Doctora. Universidad Autónoma de Madrid: 1-199.
García Tomás M., Dahmani Y., Francesch A. y Gómez Rincón C. 2009. Calidad seinal en gallo: efecto del tiempo de conservación y del diluyente. XIII Jornadas sobre Producción Animal II: 744-746.
García Triana Bárbara E., Saldaña Bernabeu Alberto y Saldaña García Leticia 2012. El estrés oxidativo y los antioxidantes en la prevención del cáncer. Revista Habanera de ciencias médicas 12 (2): 187-196.
Gastaldini Bruno, Assef Yanina, van Baren Catalina, Di leo Lira Paola, Retta Daiana, Bandoni Arnaldo Luis y González Silvia Beatriz. 2016. Actividad antioxidante en infusiones, tinturas y aceites esenciales de especies nativas de la Patagonia Argentina. Revista Cubana de Plantas Medicinales 21 (1): 51-62.
González, H. 2011. Antioxidantes en la dieta. Biosalud 6(2): 1-4.
Gumbao Baño D. David. 2015. Efecto antioxidante del glutatión aplicado en el medio de descongelación seminal de tres especies con interés. Universidad de Murcia. Departamento de Fisiología. 1-154.
Iglesias Reyes Adrian Emmanuel, Ortiz Muñiz Alda Rocío, Juárez Mosqueda María de Lourdes, Guevara González Jesús Alberto y Córdova Izquierdo Alejando. 2017. Comportamiento de la porcicultura mexicana de los años 1970 a 2017. Una revisión documental sobre su desempeño. Sociedades Rurales, Producción y Medio Ambiente 34: 153-172.
Iglesias Reyes Adrian Emmanuel. 2019. Efecto de la adición de quercetina y α-tocoferol al diluyente para la congelación del semen de verraco sobre la calidad espermática. Tesis para obtener el título de maestro en ciencias agropecuarias. Universidad Autónoma Metropolitana-Xochimilco. 1-86.
Kijpooncharoen C., Seedam S., Limruksasin S., Kaeoket K. y Chanapiwat P. 2017. Lycopene supplementation improved sperm motility of cryopreserved boar semen. Tha J Vet Med Suppl 47: 75-76.
Larbi Allai, Anass Banmoula, Marciane da Silva Maia, Boubker Nasser y Bouchra El Amiri. 2018. Supplementation of ram semen extender to improve seminal quality and fertility rate. Animal reproduction Science 192: 6-17.
Mejía Ana María. 2010. Efecto de la concentración espermática de semen porcino sobre sus características post-descongelamiento. Universidad Nacional de Colombia. Facultad de Ciencias. Maestría en Biotecnología. 1-36.
Membrillo, O. A.; Córdova, I.A.; Hicks, G. J.J.; Valencia, M. J.J. y Castillo, J.H. 2011. Efecto de la adición de antioxidantes en el diluyente de semen de macho cabrío antes de congelar y después de descongelar. Revista Veterinaria 22 (2): 85-90.
Moscardini M. M., Scott C., Souza M. D., Torre L. T., Vallejo A. V. H. y Ferreira de S. A. 2014. Viabilidad de espermatozoides ovinos mantenidos a 5° y 15°C en diferentes sistemas de refrigeración.  Ci. Vet 21 (2): 122-126.
Nuñez Antonio, Benevente Isabel, Blanco Dorotea, Boix Héctor, Cabañas Fernando, Chaffanel Mercedes, Fernández Colomer Belén, Fernández Lorenzo José Ramón, Loureiro Begoña, Moral María Teresa, Pavón Antonio, Tofé Inés, Valverde Eva, Vento Máximo y co-investigadores del ensayo clínico. 2018. Estrés oxidativo en la asfixia perianal y la encefalopatía hipóxico-isquémica. An Pediatr (Barc.) 88 (4): 228.e1-228.e9.
Olivo Zepeda IB., Flores Padilla J.P., Conejo Nava J.J., Nùñez Anita R.E. y Toscano Torres I.A. 2017. Criopreservación de semen de perro domestico (Canis familiaris) en un diluyente a base de tris-yema de huevo. Actas Iberoamericanas en Conservación Animal 9:82-87.
Orozco Benítez María Guadalupe, Navarrete Méndez Raúl, Murray Núñez Rafael y Curiel Pulido Edgar Fidel. 2014. Efecto de la temperatura en el proceso de criopreservación, sobre la motilidad progresiva del espermatozoide de cerdo. Revista EDUCATECONCIENCIA 4(5):53-64.
Oviedo Solís Cecilia Isabel, Cornejo Manzo Sinthia, Murillo Ortiz Blanca Olivia, Guzmán Barrón Michelle Montserrat. 2018. Gaceta Médica de México 154: 80-86.
Pérez Sánchez Luz Marina. 2008. Comparación de dos diluyentes para la criopreservación de semen ovino. Trabajo de grado presentado como requisito para optar al Título de Médico Veterinario. Universidad de la Salle. Facultad de Medicina Veterinaria. 1-106.
Pimentel Ramírez L.A., Urbán Duarte D., Álvarez Gallardo H., Pérez Reynozo S., De La Torre Sánchez J.F., Altamirano Solís E. y Padilla Ramírez F.J. (2016). Comparación del uso de dos diluyentes de corta duración de semen de verraco. Revista Mexicana de Agroecosistemas 3(2): 12-14.
Quintanar Escozar Martha Angélica y Calderón Salina José Víctor. 2009. La capacidad antioxidante total. Bases y Aplicaciones. Revista de educación bioquímica 28 (3): 89-101.
Restrepo B. Giovanni y Rojano Benjamín A. 2018. Actividad antioxidante del isoespintanol y el timol en el semen equino criopreservado. Revista de Investigaciones Veterinarias de Perú 29 (1):205-216.
Samillan Moya Adriana y Sánchez Valdez Heisler James. 2017. Efecto de la oxitócina sobre lipoperoxidación inducida por hiperalgesia en Rattus var. Holtzman ovariectomizadas. Tesis 1. Escuela Académico profesional de Farmacia Bioquímica. Universidad Nacional de Trujillo. 1-53.
Williams S. 2013. Criopreservación de semen porcino: desafíos y perspectivas. Revista Brasileira de Reprodução Animal 37:2, 207-2012.
Williams S., Fernández V., Gavazza M., Marmunti M, Zeinsteger P y Prenna G. 2015. Congelación de semen porcino: resultados y avances en la técnica. Analecta Veterinaria 3 (1): 17-25.
Yeste Marc, Rodríguez Gil Joan E. y Bonet Sergi. 2017. Artificial insemination with frozen-thawed boar sperm. Molecular Reproduction Development, 2017: 1-12.