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mayo 2010

Neoplasias melanocíticas en caninos, medición de la actividad de proliferación celular mediante la inmunoreactividad de antígeno Ki67. Informe preliminar.

Vet. Arg. – Vol. XXVII –  Nº  265 – Mayo 2010.
Duchene, A1; Vartabedián, A1; Gadea, P1; Verni, A1. Mira, G. 2, Márquez, A.
1: Laboratorio de Anatomía Patológica. Hospital Escuela. 2: Patologia Clínica Facultad de Ciencias Veterinarias. Universidad de Buenos Aires, Chorroarín 280, Ciudad Autónoma de Buenos Aires. República Argentina. duchene@fvet.uba.ar

Resumen.

Los tumores melanocíticos en animales domésticos varían desde formas benignas hasta altamente malignas. El diagnóstico y el pronóstico se basan principalmente en la incierta interpretación de los signos citológicos de malignidad en los cortes histológicos. El propósito del presente estudio retrospectivo fue comparar la precisión del pronóstico basado en los clásicos  criterios morfológicos comparados con el que proporciona la tinción inmunohistoquímica  con MIB-1, un anticuerpo monocolonal hacia el epitope Ki-67, que reconoce todas las células en proliferación.

Palabras claves: tumores melanocíticos, factores pronóstico, antígeno Ki67

Summary.

Melanocytic tumours in domestic animals vary from benign to highly malignant. Diagnosis and prognosis are mainly based on the uncertain interpretation of cytological signs of malignancy in histological sections. The purpose of the present retrospective study was to compare the accuracy of prognosis based on the classical morphological criteria with that provided by  immunostaining with MIB-1, a monoclonal antibody to a Ki-67 epitope that recognizes all proliferating cells.

Key words: melanocytic tumors, prognostic factors, Ki67 antigen

Introducción.

Las neoplasias  melanocíticas constituyen un grupo de tumores compuestos por células productoras de pigmento melánico  que pueden  ocurrir tanto en  animales  como en el hombre(1) . Las neoplasias pigmentarias representan del 4 al 7% de todas las neoplasias caninas. Se presentan con mayor frecuencia en caninos mayores de 10 años de edad (rango de 1 a 17) (7,9). La frecuencia de neoplasias melanocíticas  es más alta en animales de piel y mucosas pigmentadas (1, 7,9). No ha sido observada predisposición por sexo, aunque algunos autores afirman que, al igual que en humanos, la proporción de machos y hembras afectados es de 2-3:1 ( 2, 6).

Son los tumores malignos más comunes de la cavidad oral y dedos. El melanoma cutáneo, generalmente tiene un comportamiento benigno; sin embargo, las neoplasias de ubicación orofaríngea, mucocutánea e intraocular son generalmente agresivas y tienen alto potencial metastático( 6, 7, 9).

Los factores pronóstico histológicos usados fueron: el grado de anaplasia celular, la actividad de unión epitelial (foto 1), el grado de necrosis y el índice mitótico (7) (foto 2))

La medición de la actividad proliferativa se puede realizar mediante técnica de inmunohistoquímica, a través de la inmunoreactividad del antígeno Ki 67. Este antígeno es una proteína nuclear que se expresa durante la fase activa del ciclo celular (G1, S, G2, y M), estando ausente en la fase de arresto celular (G0) ( 3, 8).

El anticuerpo monoclonal Ki-67 permite la detección inmunohistoquímica de células que completan un ciclo y su expresión proporciona una medida directa de la fracción de crecimiento del tejido (4,5).

Materiales y métodos.

Se estudiaron 19 melanomas recibidos en el Laboratorio de Anatomía Patológica del Hospital Escuela durante el período comprendido entre julio-noviembre de 2008. 9 de ellos tenían localización orofaríngea, 6 en dedos y  4 en piel.

Las muestras estaban fijadas en formol al 10 % ph 7, y fueron procesadas por método histológico de rutina para inclusión en parafina. Se colorearon con Hematoxilina/Eosina (H/E) y aquellas que tenían alta carga pigmentaria que imposibilitaba observar detalles celulares, fueron decoloradas con solución decolorante de permanganato de potasio y acido oxálico. Los que presentaron dudas para su tipificación se marcaron con Melan A, Proteína S100 y Vimetina (DakoCytomation). Histológicamente se clasificaron en Melanocitomas a las neoplasias benignas y Melanomas Epiteliodes, Fusocelulares y Mixtos a las malignas. Se evaluó el pleomorfismo celular, la actividad de unión epitelial, la presencia de necrosis, la invasión vascular y el índice mitótico. Para estimar el índice de proliferación celular, se procedió a inmunomarcar con Anticuerpo monoclonal Ki 67 Clon MIB-1 (DakoCytomation), en dilución 1:75, según indicaciones del laboratorio proveedor del anticuerpo, con recuperación antigénica por calor. La medición del antígeno se realiza por la presencia de color pardo en el núcleo de las células. Como coloración de contraste se utilizó Hematoxilina.

Se realizó conteo microscópico directo, evaluándose número de células marcadas y no marcadas en 5 campos de mayor aumento tomados al azar.

Resultados.

Sobre un total de 19 neoplasias melanocíticas, 7 de 19 (36.84%) fueron clasificadas como Melanocitomas y 12 de 19 (63.16%) como Melanomas, de los cuales 6 de 12  (50%) fueron tipificados como epiteliodes, (foto 3), 3 de 12 (25%) fusiformes y 3 de 12 (25%) mixtos.  El total de los Melanocitomas no presentaron positividad para el antígeno Ki 67; por el contrario, sobre un total de 12 Melanomas malignos 8 (66%) tuvieron un porcentaje de positividad superior al 30% (foto 4) y 4 (33%) porcentajes inferiores al 15% (foto 5). Estos coincidieron con características histológicas de bajo grado de anaplasia y bajo índice mitótico. De los 8 con altos porcentajes de inmuno reactividad, 3 tenían índice mitótico bajo con alto grado de reactividad a Ki 67.

Discusión.
El poder estimar el índice de proliferación celular de estas neoplasias mediante la relación células marcadas-no marcadas, constituye un elemento con alto valor pronóstico. De lo analizado se extrae que en algunos tumores con alto grado de anaplasia y bajo índice mitótico en muestras coloreadas con H/E, en su posterior análisis inmunohistoquímico revelaron alto grado de índice de proliferación celular.

El número de muestras analizado fue bajo, debiéndose considerar esta etapa y sus resultados como una fase preliminar de trabajo.

FOTO 1: Epitelio Superficial con infiltrado celular melanocitico. H/E 40x

FOTO 1: Epitelio Superficial con infiltrado celular melanocitico. H/E 40x.

FOTO 2: Figura mitótica atípica. H/E 100x.

FOTO 2: Figura mitótica atípica. H/E 100x.

FOTO 3: Células pleomórficas pigmentarias de tipo epiteliodes. Marcado grado de anaplasia. H/E 40x.

FOTO 3: Células pleomórficas pigmentarias de tipo epiteliodes. Marcado grado de anaplasia. H/E 40x.

FOTO 4: núcleos teñidos de color pardo, positivos para Ki 67

FOTO 4: núcleos teñidos de color pardo, positivos para Ki 67.

FOTO 5: Bajo número de núcleos marcados con Ki 67, evidenciable por color pardo.

FOTO 5: Bajo número de núcleos marcados con Ki 67, evidenciable por color pardo.

Bibliografía.

1)    GROSS TL, IHRKE PJ, WALDER EJ, AFFOLTER VK. Skin Diseases of the Dog and   Cat. Clinical and Histopathologic Diagnosis. 2nd ed. Iowa: Blackwell Science, 2005.
2)    HERNÁNDEZ SZ, NEGRO VB, DUCHENE A, CATTANEO ML. Neoplasias orales en caninos: .Descripción epidemiológica de 73 casos. InVet; 1: 61-66, 1999.
3)    KOENIG A et al: Expression of S100a, vimentin, NSE, and Melan A/MART-1 inseven canine melanoma cell lines and twenty-nine retrospective cases of caninemelanoma. Vet Pathol 38:427-435, 2001.
4)    MADEWELL, B.R:  Cellular proliferation in tumors: a review of methods, interpretation and clinical applications. J. Vet Intern Med, 15(4): 334-340, 2001.
5)    MILANTA, F; FRATINI, F; CORAZZA, M; CASTAGNARO, M; ZAPPULLYM V; POLI, A: Proliferation activity in oral and cutaneous canine melanocytic tumours: correlation with histological parameters, location and clinical behaviour. Res Vet Sci, 73 (1): 45-51, 2002.
6)    OGILVIE, G.K.: Manejo del paciente canino oncológico. Editorial Inter-Médica.  Capítulo 54, pag.575-590, 2008.
7) RAMOS-VARA JA, BEISSENHERZ ME, MILLER MA, JOHNSON GC, PACE LW, FARD A ET AL. Retrospective study of 338 canine oral melanomas with clinical, histologic, and immunohistochemical review of 129 cases. Vet Pathol; 37: 597-608, 2002.
8)    ROELS,  S; TILMANT, K; DUCATELLE, R: PCNA and Ki67 proliferation markers as criteria for prediction of clinical behaviour of melanocytic tumours in cats and dogs. J Comp Pathol. Jul;121(1):13-24, 1999.
9)    SMITH SH, GOLDSCHMITDT MH, MCMANUS PM. A comparative review of melanocytic neoplasms. Vet Pathol; 39: 651-678, 2002