Vet. Arg. - Vol. XXX - Nº 298 - Febrero 2013.
Puente M.A.¹, Tartaglione M.¹

Resumen.
La refrigeración de semen es una técnica utilizada en muchas especies. Esta práctica nos permite la conservación para su utilización en programas de inseminación artificial, pero el daño que provoca el almacenamiento en las estructuras de la membrana se ve reflejado en una disminución de la viabilidad y motilidad de las células expuestas a estas condiciones. Si bien en los últimos años se ha progresado en las técnicas de conservación del semen en forma refrigerada, los resultados son variables. El objetivo de este trabajo fue evaluar el efecto in vitro sobre la viabilidad de espermatozoides de tres diluyentes: Solución Betsville (BTS), Tris-Acido Cítrico-Glucosa (TCG) y diluyente comercial (DC) a 15ºC almacenado 24 horas. Se utilizaron conejos machos sexualmente maduros de raza Neozelandez Blanca. Los parámetros seminales evaluados fueron la viabilidad (V), la motilidad progresiva rectilínea (MPR) y la integridad de membrana plasmática (IMP). El análisis de los indicadores de la calidad seminal con los diluyentes TCG y el DC reflejaron ser más eficaces que el BTS para la conservación del semen de conejo en forma refrigerada.
Palabras clave: Semen refrigerado, diluyente, calidad seminal, conejo.

Evaluation of three extenders on cooled semen quality rabbit.
Summary.
Cooling semen is a technique used in many species. This practice allows the conservation for use in artificial insemination programs, but the damage it causes storage in the membrane structures is reflected in a decrease of the viability and motility of cells exposed to these conditions. While in recent years there has been progress in conservation techniques semen cooled, the results are variable. The aim of this study was to evaluatethe “in-vitro” effect on sperm viability of three extenders: Betsville Solution (BTS), Tris-citrate-glucose (TCG) and commercial extender (DC) stored at 15ºC for 24 h. Were used sexually mature male rabbits of the White New Zealand breed. The sperm parameters evaluated were the viability (V), the rectilinear progressive motility (MPR) and the cell membrane integrity (IMP). The analysis of indicators of sperm quality with extenders TCG and DC showed to be more effective than the BTS for rabbit semen conservation in refrigerated form.

Keywords: cooled semen, extender, semen quality, rabbit.
¹ Facultad de Ciencias Agrarias - U.N.L.Z.
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Introducción.
La refrigeración del semen es una alternativa para la conservación de espermatozoides al reducir la tasa de metabolismo celular permitiendo así extender su supervivencia en períodos cortos de tiempo lo cual permite una mejor organización del trabajo en granja y la posibilidad de realizar el traslado y la difusión de semen para su posterior uso en granjas, en especial para los pequeños y medianos productores los cuales no poseen acceso a machos de calidad superior. La conservación del semen en forma refrigerada ofrece resultados variables debiéndose incrementar el número de espermatozoides por dosis para lograr altas tasas de fertilidad reduciendo así el número de dosis útiles por macho (Alvariño et al, 1996; Viudes de Castro et al, 1997). Diferentes diluyentes han sido probados para evaluar su capacidad para mantener la viabilidad del semen en el tiempo de refrigerado (Castellini, 1998). Roca (2000) concluyó que el diluyente TCG conserva la capacidad fecundante de los espermatozoides de conejo durante 48 hs. a 15 ºC. Por otro lado el BTS, diseñado en un principio como medio de descongelación y que fue adaptado al semen refrigerado, probablemente el más utilizado en todo el mundo, en especial en semen porcino, se caracteriza por contener una pequeña cantidad de potasio que permite mantener la actividad de la bomba sodio-potasio y evita la reducción de potasio intracelular que estaría asociada con la disminución de la motilidad. (Alvarez y Storey, 1982). La utilización del semen refrigerado en inseminación artificial (IA) en la producción cunícola genera el beneficio de un incremento del número de hembras productivas al reducirse o eliminarse los machos, la posibilidad de establecer una producción en bandas y como herramienta para la mejora genética. El objetivo del presente estudio fue evaluar in vitro la calidad del semen (muestras individuales) diluido en tres diluyentes distintos, BTS, TCG y DC, refrigerados a 15ºC y almacenados durante 24 horas.

Materiales y métodos.
Para este estudio se utilizaron conejos machos de la Raza Neozelandés Blanco sexualmente maduros. Los conejos se mantuvieron individualmente en ambiente con luz controlada (16 L : 8 O) y fueron alimentados con una dieta comercial y agua ad libitum. El semen fue recolectado una vez por semana, dos eyaculados por macho a intervalos de 30 minutos. El semen se recogió mediante una vagina artificial a 42 º C y en caso de presencia del tapón mucoso en el eyaculado, el mismo fue retirado mediante una pinza. Se evaluó cada eyaculado en forma macroscópica observando el color, olor y volumen medido en un tubo colector graduado. Posteriormente se realizo una observación microscópica de la motilidad masal colocando 10 μl de semen sobre un portaobjetos y sólo eyaculados con la motilidad masal > 3 en una escala 0-5 fueron fraccionados y diluidos. Los eyaculados fueron fraccionados en tres alícuotas, se diluyeron (1:1) con los diferentes diluyentes: TCG (0,25 M tris hidroximetil aminometano, 88 mM de ácido cítrico anhidro, 47 mM de glucosa), BTS (glucosa 37 g, 6 g de citrato de sodio, EDTA 1,25 g, bicarbonato de sodio 1,25 g y cloruro de potasio 0,75 g) y DC. Los parámetros de calidad seminal evaluados fueron los siguientes: la V evaluada mediante un frotis con la tinción eosina-nigrosina (Bamba, 1988), la MPR evaluada subjetivamente mediante el examen de los espermatozoides a 37 º C en una muestra de semen diluido 1:100 por microscopía de contraste de fase (X100) y la IMP a través del test de hipoosmosis combinado con la tinción supravital (TSHOS) (Tartaglione y Ritta, 2004). Los resultados se presentan como media ± SEM. Los datos fueron analizados mediante un análisis de varianza (ANOVA). Una diferencia estadísticamente no significativa fue aceptada cuando el valor p fue <0,05.

Resultados.
Los efectos del almacenamiento en forma refrigerada a 15 ºC durante 24 horas sobre los parámetros de calidad seminal, evaluados en espermatozoides diluidos con TCG, BTS y DC, se presentan en el Cuadro 1 y Gráfico A, donde se muestran los valores medios y el desvío estándar para la V, MPR e IMP. En los tres parámetros analizados los resultados obtenidos muestran que no hay diferencias significativas entre el diluyente TCG y DC (P<0,05). Sin embargo, las muestras de semen diluidas con BTS dieron como resultados valores más bajos en los tres parámetros seminales evaluados con una diferencia estadísticamente significativa con respecto a los resultados obtenidos con los otros dos diluyentes en estudio. Si bien estadísticamente no difieren los resultados entre los diluyentes TCG y DC, existe una pequeña superioridad en los valores de la viabilidad y motilidad cuando el diluyente usado es el TCG, sin embargo, la IMP dio una tendencia superior con el DC.

Discusión y conclusiones.
El conocer con certeza como disminuyen los parámetros de calidad seminal en el tiempo de almacenamiento con diferentes diluyentes nos permite realizar al momento de la extracción de semen, dosis con una cantidad mínima de espermatozoides para obtener al momento de la inseminación artificial óptimas tasas de fertilización (Viudes de Castro y Vicente, 1997). El semen refrigerado es una técnica que nos permite mantener la viabilidad y capacidad fecundante de los espermatozoides por un período corto de tiempo. El efectivo uso de la técnica de inseminación artificial en conejos depende de la eficiencia del diluyente para proteger a los espermatozoides en el tiempo durante el almacenamiento tratando de mantener los parámetros de calidad del semen eyaculado. El lograr mantener la calidad seminal en el tiempo trae aparejado la posibilidad de realizar dosis con menos espermatozoides y así poder aumentar la cantidad de inseminaciones que se pueden obtener de cada eyaculado. El número de espermatozoides es un factor de suma importancia que influye en forma directa en la tasa de concepción (Alvariño et al., 1998) varios autores han realizado estudios para determinar el número óptimo de espermatozoides para obtener buenas tasas de preñez estos estudios concluyen que el diluyente es uno de los factores más importantes a tener en cuenta para determinar la cantidad de espermatozoides por dosis a utilizar. En el presente estudio se observó para los tres parámetros de calidad seminal evaluados: V, MPR e IMP, en muestras diluidas y almacenadas por 24 horas a 15ºC, valores superiores en muestras diluidas con TCG y DC con una diferencia significativa con respecto a las muestras diluidas con BTS. Comparando los resultados entre TCG y DC, no se encuentran diferencias estadísticas significativas entre si, aunque hay una leve superioridad en los valores de TCG para los parámetros de V y MPR, pero no así para la IMP donde el valor de STHOS fue levemente superior con el DC. Se puede concluir que los diluyentes TCG y DC son más efectivos que el BTS para la dilución y almacenamiento de semen de conejo a 15ºC durante 24 horas.

BIBLIOGRAFÍA.

1. Alvarez J.G., Storey B.T., 1982. Spontaneous lipid peroxidation in rabbit epididymal spermatozoa: its effect on sperm motility. Biol Reprod 27, 1102-1108.
2. Alvariño, J.R.M.; Lopez, F.J.; Del Arco, J.A. ; Bueno, A.; Torres, R. 1998. Effect of semen concentration on Rabbit artificial insemination wiyh fresh or 24 hours stored semen. 6 th. World Rabbit Congress, vol.2: 33-35.
3. Castellini, C., 1996. Recent advances in rabbit artificial insemination. In: Proceeding of 6thWorld Rabbit Congress, Toulouse, France, Vol. 2, pp. 13–26..
4. Johnson L.A., Aalbers J.G., Groote, H.J.G. 1988. Artificial insemination of swine: Fecundity of boar semen stored in Beltsville Thawing Solution (BTS), modified modena (MM), or MR-A and inseminated on one, three and four days after collection. Zuchthyg 23, 49-55.
5. Pursel, V.G., Johnson, L.A., 1975. Freezing of boar spermatozoa: fertilization capacity of semen and a new thawing procedure. J. Anim. Sci. 40: 99-102.
6. Roca, J., Martínez, S., Vázquez, J.M., Lucas, X., Parrilla, I., Martínez, E.A. 2000. Viability and fertility of rabbit spermatozoa diluted in Tris-buffer extenders and stored at 15ºC. Animal Reproduction Science, 64, 103–112.
7. Viudes de Castro ,M.P., Vicente, J.S., 1997, Effect of sperm count on the fertility and prolificity rates of meat rabbits. Animal Reproduction Science 46, 313-319.
8. Tartaglione, C.M., Ritta, M.N. 2004. Prognostic value of spermatological parameters as predictors of in vitro fertility of frozen-thawed bull semen. Theriogenology, 62: 1245-1252.
   

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