keyboard_arrow_up
abril 2015

Los ácidos biliares y su relación con la análisis de concentración de colesterol total, triglicéridos y glucosa en el perro con Síndrome de Cushing.

Vet. Arg. – Vol.  XXXII –  Nº  324 – Abril 2015.
Ortemberg, L1-3; Castillo, VA 1-2 *; Cabrera Blatter, MF 1-2; Feijoo, S1-3; Brañas, M1; Gomez, NV1;  Martiarena, B1; Loiza, M1; Miceli, DD 2-4

 Resumen
El Síndrome de Cushing suele cursar con dislipemia provocada por el aumento del colesterol y los triglicéridos circulantes. Los ácidos biliares son sintetizados en el hígado a partir del colesterol y están relacionados con el control de las vías metabólicas de lípidos y glucosa. Se estudiaron los ácidos biliares (ayuno y postprandiales), colesterol, triglicéridos y glucemia en 15 perros con Síndrome de Cushing. Las concentraciones de ácidos biliares en ayuno se hallaron elevados (>25μmol/L) en 3/15 perros y cercanos al límite de corte (20-25μmol) en 8/15, estando correlacionados con el cortisol (r=0,62; P=0,014); colesterol (r=0,66; P=0,007) y triglicéridos (r=0,60, P=0,017). La concentración posprandial de ácidos biliares fue  >50μmol/L en los 15 animales. Por ultrasonografía, en 9/15 perros había barro biliar y en la totalidad hepatomegalia con imagen compatible con esteatosis. Se concluye que en el Síndrome de Cushing los ácidos biliares están relacionados con las concentraciones de cortisol, colesterol y triglicéridos. Por otra parte, los ácidos biliares podrían jugar un papel en el mantenimiento de altas concentraciones de cortisol y en mantener activada la vía metabólica de los lípidos.

Palabras clave: Síndrome de Cushing, ácidos biliares, hiperadrenocorticismo, dislipemia..

Bile acids analysis in dogs with Cushing Syndrome: its relationship with cortisol, total cholesterol, triglycerides and glucose concentration

Summary
Cushing’s  Syndrome  usually courses with an increase of circulating total cholesterol and triglycerides. The bile acids are synthesized in the liver from cholesterol and are being related to the control of the metabolic paths of lipids and glucose. We found in dogs with Cushing’s syndrome that the bile acids concentrations during fast were increased (>25 μmol/L) in 3/15 dogs and close to the upper cut limit (20-25 μmol/L) in 8/15, being correlated with cortisol (r=0.62; P=0.014), cholesterol (r=0.66; P=0.007) and triglycerides (r=0.60, P=0.017). Postprandial concentrations of bile acids were significant higher than in control group. Ultrasonography showed that 9/15 dogs had biliary sludge. In conclusion, fasting bile acids in patients with Cushing’s syndrome are related with the concentrations of cortisol, cholesterol and triglycerides. At the same time, bile acids could play a role to maintain both high concentration of cortisol and activated the metabolic pathways of lipids.

Keywords:  Cushing’s Syndrome, bile acids, hyperadrenocorticism, dislipedemia.

1 Cát. Clin Med Peq Animales y Hospital Escuela de Medicina Veterinaria, 2U. Endocrinología y 3U. de Gastroenterología, 4Becario CONICET; Facultad de Ciencias Veterinarias, Universidad de Buenos Aires. Av. Chorroarin 280 (1424) Ciudad Autónoma de Buenos Aires, Arg.
*e-mail:  vcastill@fvet.uba.ar

 Introducción
El Síndrome de Cushing (SC), cursa con una serie de alteraciones bioquímicas provocadas por el hipercortisolismo, viéndose afectadas diversas vías metabólicas 1. Los glucocorticoides regulan a las enzimas que intervienen en el metabolismo de glúcidos y lípidos; estimulando la gluconeogénesis, y gliceroneogénesis hepática, favoreciendo la síntesis de glucosa (G), colesterol y triglicéridos (Tg), siendo su efecto contrarios al de la insulina (insulinorresistencia) afectándose, entre otros tejidos, el hepatocito y el tejido adiposo. Debido a la insulinorresistencia establecida se ven alteradas las vías metabólicas de la glucosa y lípidos, hallándose hiperactivadas 5. La consecuencia será la tendencia a la hiperglucemia en ayuno, hipertrigliceridemia, hipercolesterolemia y aumento en circulación de los ácidos grasos libres (AGL), situaciones observadas tanto en humanos como en perros 15, 23, 31. En individuos con hipercortisolismo los AGL llegan en mayor cantidad al hígado, provocando la esteatosis hepática 2. En el hígado los AGL  serán metabolizados a Tg (glicerogénesis) como también pasan a la vía de síntesis del colesterol, ambos procesos hiperactivados en el SC 1.

En el hígado, el colesterol interviene en la síntesis de ácidos biliares (AB), que son excretados mediante la bilis hacia el intestino delgado 7, 8, 13. Si bien históricamente se han considerado, incluso en perros, a los AB como indicadores de daño hepatocelular, alteraciones de la perfusión portal o presencia de fenómenos colestásicos (como la esteatosis hepática), estudios recientes realizados tanto en humanos como animales de experimentación demuestran que los AB cumplen un importante papel regulador en diferentes vía metabólicas, entre ellas la de lípidos y glucosa, pudiendo incluso afectar dichas vías 17, 22.

El propósito del presente estudio fue analizar cómo se hallan los AB en perros con SC y si los mismos se relacionan o no con las concentraciones de cortisol, colesterol, triglicéridos y glucosa.

Materiales y métodos

Población de estudio
a) Grupo Cushing (GA): se estudiaron 15 perros con diagnóstico confirmado de SC ACTH dependiente de la hipófisis (5 machos, 10 hembras, de las cuales 3 estaban castradas), siendo la mediana de edad 9,2 años (rango 4-13 años). Los criterios de inclusión fueron: concentración de Tg <500 mg/dL (5,6 mmol/L), ya que con valores mayores de Tg el suero es muy túrbido o lechoso, interfiriendo con las determinaciones de otras variables 21. No debían padecer de diabetes mellitus, insuficiencia renal o hepática, enfermedad infecciosa y neoplasias. El criterio diagnóstico de SC utilizado en la institución mencionada es 12: 1) presencia de al menos 5 signos clínicos característicos de la enfermedad y de evaluación objetiva (polidipsia-poliuria, abdomen prominente, ganancia de peso, pérdida de pelo y cambio en su estructura, pérdida de elasticidad y grosor de la piel, ausencia de ciclo estrual por más de un año en la perra); 2) confirmación diagnóstica por medio de la Relación Cortisol/Creatinina en orina, determinada pre y posterior a la inhibición con dexametasona en alta dosis por vía oral 11, medición de adreno-corticotropina (ACTH) plasmática, ecografía de las glándulas adrenales y Resonancia Magnética de la región selar.

Así, del total de 46 perros diagnosticados durante el año con SC ACTH dependiente de la pituitaria, solo 15 fueron admitidos al estudio, ya que 10/46 tuvieron Tg >500mg/dL (>5,6 mmol/L), 4/46 disfunción renal, 5/46 diabetes mellitus y de 12/46 perros los propietarios no dieron su consentimiento para realizar el test dinámico para AB ni la biopsia hepática.b) Grupo Control (GB): se trató de 10 perros sanos (4 machos y 6 hembras, 2 de ellas castradas) cuyos dueños consintieron en realizar los estudios bioquímicos descriptos a continuación. La mediana de edad fue de 6,2 años (3-8 años).

Análisis bioquímico
Se estudiaron en el suero de ambos grupos las siguientes variables: cortisol, colesterol total, Tg, glucosa, AB (en ayuno y postprandial) y las enzimas hepáticas alanin aminotransferasa (ALT/GPT), aspartato aminotransferasa (AST/GOT) y fosfatasa alcalina (FAL). Las muestras de sangre (5 mL) se colectaron por venopunción estando los perros con 12 horas de ayuno sólido. Excepto para el cortisol y AB, para el resto de las variables la medición de la mismas se realizó por método automatizado de laboratorio (Autoanalyzer Metrolab Merck, Germany), según las instrucciones del fabricante (Wiener Labs, USA). Estas variables sólo se estudiaron en ayuno.

Los AB fueron medidos por el método enzimático colorimétrico (Randox Bile Acids test, Randox, UK) utilizando el autoanalizador mencionado previamente, siendo la precisión intra e interensayo de 4% and 2.8% respectivamente. Según el fabricante del kit, no hay interferencia con concentraciones de Tg >500mg/dl, tanto en ayuno como postprandial. Para el estudio de AB se tomaron muestras en ayuno y 1 hora postprandial de la siguiente manera: de la misma muestra obtenida para analizar las otras variables, se estudiaron los AB de ayuno. Posteriormente a la obtención de la extracción de sangre se procedió a suministrar al perro una dieta consistente en consistente en 40mL (2 cucharadas soperas) de aceite de oliva, 1 huevo crudo y 250 grs de carne picada cruda, realizándose a la hora una nueva extracción de sangre para AB (postprandial). Valores de ayuno >25 μmol/L  son sugerentes de anormalidad hepatobiliar; valores  >50 μmol/L (ayuno o postprandial) son indicadores de daño hepatobiliar, disfunción hepática o alteración en la fluidez de la bilis 6.

El cortisol sérico fue evaluado por medio de un enzimoinmunoensayo  (DetectX® Cortisol Immunoassay, Arbor Assays, USA). El coeficiente de variación intra e interensayo fue de 5,6% and 6,5% respectivamente

El cortisol, fracciones lipídicas mencionadas, glucosa y enzimas hepáticas no pudieron ser evaluadas a la hora postprandial a la par de los AB de ese tiempo por causa del suero hiperlipémico, lo que impide su determinación por la metodología de laboratorio utilizada.

 Diagnóstico por imágenes: ultrasonografía
El hígado y  la vesícula biliar fueron evaluados mediante ultrasonografía abdominal con el animal en ayunas de 12 horas y preparación previa del abdomen. El equipo utilizado fue un Fukuda Denshi 750 con un transductor de multifrecuencia de 6.5 – 8 MHZ. El estudio se realizó el mismo día de la extracción de sangre.

Biospsia hepática
La biopsia hepática se realizó en los 15 perros con SC con el propósito de determinar que no hubiese daño hepático (necrosis, inflamación, toxicidad), estando los perros en ayuno de 12 hrs  y 7 días después de haberles realizado los estudios mencionados. Previamente a la toma de muestra se realizaron los siguientes test de coagulación: tiempo de protrombina (Tiempo de Quick), el tiempo de activación parcial de tromboplastina (KPTT) y recuento de plaquetas. Dichos estudios fueron normales en todos los perros.

La obtención de la muestra de hígado se hizo con guía ultrasonográfica, bajo sedación y utilizando un Tru-cut 16-18 gauges. Una vez obtenida la muestra, fue colocada en formol al 10% bufferado para ser procesada previa fijación en taco de parafina. Se realizaron tinciones con hematoxilina-eosina, PAS (hidratos de carbono) y SUDAN (lípidos). En el grupo control no se llevó a cabo la biopsia hepática por ser considerada innecesaria por el comité de ética, dado que son animales sanos y que no aportaría información relevante.

Análisis estadístico
Los valores de las diferentes variables estudiadas son expresados como mediana y rangos. La comparación de las medianas entre ambos grupos se hizo por medio del test de Mann-Whitney. Los AB en ayuno fueron correlacionados con el cortisol, colesterol total, Tg, G y enzimas hepáticas por medio del test de Correlación de Spearman. Se considera significativo el valor de P<0,05.

Aprobación ética
El estudio fue aprobado por el comité de ética de la Facultad de Ciencias Veterinarias de la Universidad de Buenos Aires (CICUAL) en el marco de los proyectos UBACyT V006 y UBACyT 2011-1014 (cod20020100100246). Los propietarios de los perros dieron su consentimiento firmado para la participación en el mencionado proyecto y la realización de las pruebas diagnósticas solicitadas.

Resultados
Estudios bioquímicos.
En la tabla 1 se resume los valores obtenidos en ambos grupos. Las concentraciones de cortisol fueron significativamente elevadas (P=0,04) en el Grupo A vs el GB. También las concentraciones del colesterol total, los triglicéridos y la glucosa fueron significativamente más elevadas (P<0,0001 para el colesterol total y Tg, y P=0,003 para la glucosa) en el GA vs el GB.

Tabla 1: Concentraciones de las diferentes variables estudiadas en perros del GA y GB. 

Los valores son expresados como mediana y rangos. Valores de referencia (Laboratorio de Patología Clínica, Hospital Escuela de Medicina Veterinaria, FCV,UBA): Cortisol: 0,8-5 µg/dL; Colesterol: 60-250 mg/dL; Tg: 50-130 mg/dL; Gucosa: 60-110 mg/dL; FAL: hasta 300 UI/L; ALT/GPT y AST/GOT hasta 80 UI/L  (a) P=0,04; (b) P<0,0001; (c) P=0,003; (d) P<0.001; (e) P=0,003; (ns): no significativo; Grupo A vs Grupo B.

Los valores son expresados como mediana y rangos. Valores de referencia (Laboratorio de Patología Clínica, Hospital Escuela de Medicina Veterinaria, FCV,UBA): Cortisol: 0,8-5 µg/dL; Colesterol: 60-250 mg/dL; Tg: 50-130 mg/dL; Gucosa: 60-110 mg/dL; FAL: hasta 300 UI/L; ALT/GPT y AST/GOT hasta 80 UI/L
(a) P=0,04; (b) P<0,0001; (c) P=0,003; (d) P<0.001; (e) P=0,003; (ns): no significativo; Grupo A vs Grupo B.

No hubo diferencias significativas entre ambos grupos para los valores de ayuno de  AB (Fig.1), si bien en el GA  éstos estuvieron elevados (>25 μmol/L) en 3/15 perros y cercanos a su valor de corte máximo (20-25 μmol/L) en 4/15 perros. Respecto al tiempo postprandial, las concentraciones de los AB fueron mayores en el GA respecto al GB (P=0,0001). Como era de esperar, las enzimas hepáticas, a excepción de GOT estuvieron elevadas en el GA.

Fig.1. Concentración de AB en ayunas y 2 horas postprandial en los Grupos A y B. Es notable el mayor incremento postprandial en el GA respecto del otro grupo. *** P = 0,0007 ayuno vs. 2 horas postprandial GA; **P= 0,006 ayuno vs. 2h postprandial GB; δδδP<0,0001 tiempo postprandial entre GA vs. GB Cada símbolo representa un perro. La línea punteada indica el valor de corte máximo en ayuno y postprandial. La línea sólida indica la mediana.

Fig.1. Concentración de AB en ayunas y 2 horas postprandial en los Grupos A y B. Es notable el mayor incremento postprandial en el GA respecto del otro grupo.
*** P = 0,0007 ayuno vs. 2 horas postprandial GA; **P= 0,006 ayuno vs. 2h postprandial GB; δδδP<0,0001 tiempo postprandial entre GA vs. GB
Cada símbolo representa un perro. La línea punteada indica el valor de corte máximo en ayuno y postprandial. La línea sólida indica la mediana.

El estudio de correlación mostró que las concentraciones de AB en ayuno del GA correlacionaron significativamente con el cortisol (r=0,62, P=0,014), colesterol total (r=0,66, P=0,007) y los Tg (r=0,60; P=0,017). No se encontró correlación significativa con la glucosa y las enzimas hepáticas. En el GB no se encontró correlación alguna entre los AB y el resto de las variables.

Ultrasonografía y biopsia hepática.
El estudio ultrasonográfico del GA mostró hepatomegalia, con patrón infiltrativo de tipo metabólico infiltrativo, imágenes consideradas como características de esteatosis hepáticas. Nueve de 15 perros del GA también presentaron barro biliar y distensión de la vesícula biliar (Fig 2).

Fig.2. Ejemplo ultrasonográfico de la vesicular biliar de un perro del GB (a) y de otro del GA con distención de la vesícular biliar y contenido de barro biliar (b).

Fig.2. Ejemplo ultrasonográfico de la vesicular biliar de un perro del GB (a) y de otro del GA con distención de la vesícular biliar y contenido de barro biliar (b).

La biopsia hepática reporto hepatocitos con vacuolización intracitoplasmática de posible orígen metabólico (Fig 3). La tinción PAS fue negativa y positiva la tinción SUDAN (datos no mostrados).

Fig.3. Biopsia de hígado donde se puede ver la degeneración vacuolar característica en la esteatosis metabólica como el caso del SC. Hematoxilina-eosina, amplificación 40X

Fig.3. Biopsia de hígado donde se puede ver la degeneración vacuolar característica en la esteatosis metabólica como el caso del SC. Hematoxilina-eosina, amplificación 40X

Discusión
Si bien es conocido que el hipercortisolismo cursa con dislipemias caracterizadas por el aumento del colesterol, Tg y con tendencia a la hiperglucemia o hiperglucemia franca 15, 31,hasta el presente (en el conocimiento de los autores) no se habían estudiados los AB en perros con SC y su relación con las variables mencionadas. Si bien el número de pacientes es limitado, los AB en ayuno correlacionaron con el cortisol, colesterol total y Tg. En el tiempo postprandial, los AB del GA fueron significativamente más elevados respecto al grupo control, lo que indicaría no sólo la mayor síntesis de ellos, debido a la mayor llegada de colesterol y Tg al hígado, sino también la probable presencia de colestasis hepática debida a la esteatosis y menor flujo biliar.

Últimamente se han descripto nuevas funciones de los AB, en particular en lo referente a la regulación y coordinación de diferentes vías y pasos metabólicos, entre ellos de los lípidos y de la glucosa 14, 29. En el presente estudio los AB se encontraron elevados en ayuno o en valores cercanos al límite de corte en la mitad de los perros estudiados estando alterados tanto los lípidos analizados como la glucosa. El colesterol y los triglicéridos en el hígado inducen la síntesis de AB en el perro, incrementando sus concentraciones sin haber daño hepatobiliar ni procesos colestásicos 7,  8, 13.

Si bien las concentraciones de cortisol en el GA eran de esperarse, es llamativa su correlación con los AB de ayuno en este grupo, sin haberla en el GB. Estudios realizados por Stauffer y col 27 en personas con cirrosis hepática y obstrucción biliar extrahepática describieron que el cortisol persiste en circulación por más tiempo debido que los AB afectan la expresión de la enzima 11β-hydroxysteroide dehydrogenasa (interconvierte el cortisol a corticosterona y viceversa). Por otra parte, el cortisol también induce la síntesis de AB  como también la formación de barro biliar 18. Esto explicaría la correlación observada entre AB y cortisol como también el hecho que 9/15 (60%) perros con SC presentaran barro biliar. Estos hallazgos concuerdan con lo informado por Mesich y col 19, quienes informan que los perros con SC tienen 29 veces más riesgo de generar barro biliar. Estos hallazgos no fueron observados en el grupo control.

Es esperable que el colesterol, Tg y glucosa se encuentren elevados en el SC, como está ampliamente descripto 1. En este estudio el colesterol y los Tg del GA correlacionaron con los AB. Diversos autores han postulado que los AB están involucrados en la regulación y coordinación de las vías metabólicas de los lípidos e hidratos de carbono 14, 24, 22, 29. Por la naturaleza del estudio no se puede decir que los AB en el perro con SC estén estimulando dichas vías metabólicas ejerciendo un efecto sinérgico con el cortisol, siendo materia de mayores estudios. La correlación entre el colesterol y AB en el GA se explica por la mayor llegada al hígado tanto del lípido como de ácidos grasos libres, estimulando así la mayor síntesis de los AB 23,25.

La correlación hallada entre los Tg y AB en los perros con SC se debe en parte a la llegada de gran cantidad de ácidos grasos libres, los cuales pasan directamente a la síntesis de Tg 23. Por otra parte, se sabe que los AB regulan la síntesis de Tg a través de la modulación del receptor farnesoide X  4, 13, 14, 16, por lo que el aumento de los AB llevaría a la mayor síntesis de Tg.

Referente a las enzimas hepáticas, el cortisol induce el aumento de la actividad enzimática de dichas enzimas aumentando sus concentraciones en el suero sin haber daño hepatocellular o necroinflamatoria. En nuestro estudio, FAL y ALT/GPT se encontraron elevadas como es habitual en el hipercortisolismo sin haber daño hepático acorde a los resultados de la biospsia hepática realizado a los perros del GA. Estos hallazgos refuerzan la idea que el incremento de los AB en el SC serían provocados por el efecto del cortisol, colesterol y Tg, además de haber colestasis por efecto de la hepatomegalia y no por daño celular del hepatocito.

En conclusión, el aumento de los AB en perros con SC ACTH dependiente de la hipófisis se relaciona con las mayores concentraciones de cortisol, colesterol y Tg características de ésta endocrinopatía y que estarían induciendo una mayor síntesis de AB. A su vez, el incremento de la síntesis de los AB provocará la formación de barro biliar. Estos eventos no fueron observados en el grupo control.

 Agradecimientos
 Proyecto subsidiado por UBACyT, Universidad de Buenos Aires.

Bibliografía.

1-    Beale, E.G., Hamme, R.E., Antonie, B., Forest, C. Disregulated glyceroneogenesis: PCK1 as a candidate diabetes and obesity gene. Trends Endocrino Metab. 2004; 15:129-135.

2-    Browning, J.D., Horton, J.D. Molecular mediators of hepatic steatosis and liver injury. J Clin Investig. 2004; 114:147-152.

3-    Brufau, G., Kuipers, F., Prado, K., Abbey, S., Jones, M., Schwartz, S., Stellaard, F., Murphy, E.. Altered bile salt metabolism in type 2 diabetes mellitus (T2DM) (Abstract). Diabetes. 2008; 57 (Suppl.1): A435

4-    Cao, R., Cronk, Z.X., Zha, W., Sun, L., Wang, W., Fang, Y., Studer, E., Zhou H., Pandak, W.H., Dent, P., Gil, G., Hylemon, P.B.. Bile acids regulate hepatic gluconeogenic genes and farnesoid X receptor via Ga-i protein coupled receptors and the AKT pathway. J Lipid Res. 2010; 51:2234–2244.

5-    Catchpole, B., Ristic, J.M., Fleeman, L.M., Davison, L.J. Canine diabetes mellitus: can old dogs teach us new tricks? Diabetologia. 2005; 48:1948–1956.

6-    Center, S.A.  Diseases of the gallbladder and billiary tree.  Vet Clin North Am Small Anim Pract. 2009; 39: 543-598.

7-    Chiang, J.Y.L. Bile acids: regulation of synthesis. J Lipid Res 2009; 50:1955-1966.

8-    Dawson, P.A., Lan, T., Rao, A. Bile acid transporters. J Lipid Res. 2009; 50:2340-2357.

9-    Duran-Sandoval, D., Mautino, G., Martin, G. et al. Glucose regulates the expression of the farnesoid X receptor in liver. Diabetes. 2009; 53:890–898.

10-  Duran-Sandoval, D., Cariou, B., Percevault, F. et al. The farnesoid X receptor modulates hepatic carbohydrate metabolism during the fasting/refeeding transition. J Biol Chem. 2009; 280:29971–29979.

11-  Galac, S., Kooistra, H., Teske, E., Rijnberk, A. Urinary corticoid/creatinine ratios in the differentiation between pituitary-dependent hyperadrenocorticism and hyperadrenocorticism due to adrenocortical tumour in the dog. Vet Q. 1999; 19:17-20.

12-  Gallelli, M.F., Cabrera Blatter, M.F., Gómez, N., Castillo, V.A. Comparative study by age and gender of the pituitary adenoma and ACTH and α-MSH secretion in dogs with pituitary-dependent hyperadrenocorticism. Res Vet Sci. 2010; 88:33–40.

13-  Hofmann, A.F. Biliary secretion and excretion in health and disease: current concepts. Ann Hepatol. 2007; 6:15-27.

14-  Houten, S.M., Watanabe, M., Auwerx, J. Endocrine functions of bile acids. The EMBO J. 2006; 25:1419-1425.

15-  Jericó, M.M., De Camargo Chiquito, F., Kajihara, K. et al. Chromatographic analysis of lipid fractions in healthy dogs and dogs with obesity or hyperadrenocorticism. J Vet Diagn Invest. 2009; 21: 203-207.

16-  Kast, H.R., Nguyen, C.M., Sinal, C.J. et al. Farnesoid X-activated receptor induces apolipoprotein C-II transcription: a molecular mechanism linking plasma triglyceride levels to bile acids. Mol Endocrinol. 2001; 15: 1720-1728.

17-  Keitel, V., Kubitz, R., Haussinger, D. Endocrine and paracrine role of bile acids. World J Gastroenterol. 2008; 14:5620–5629.

18-  Kook, P.H., Schellenberg, S., Rentsch, K.M., Reusch, C.E., Glaus, T.M. Effects of iatrogenic hypercortisolism on gallbladder sludge formation and biochemical bile constituents in dogs.  Vet J. 2012; 191: 225-230

19-  Mesich, M.L.L., Mayhew, P.D., Paek, M., Holt, D.E., Brown, D.C. Gall
bladder mucoceles and their association with endocrinopathies in dogs: aretrospective case-control study. J Small Anim Pract.  2009; 50: 630–635.

20-  Michael, M.D., Kulkarni, R.N., Postic, C. et al.Loss of insulin signaling in hepatocytes leads to severe insulin resistance and progressive hepatic dysfunction. Mol Cell. 2000; 6:87-97.

21-  Nelson, R.W., Turnwald, G.H., Willard, M.D. Endocrine, metabolic, and lipid disorders. In: Willard, M.D., Tvedten, H. (Eds.). Small Animal Clinical Diagnosis by Laboratory Methods. Saunders St. Louis, Missouri. 2000. 165–207.

22-  Nguyen, A., Bouscarel, B. Bile acids and signal transduction: role in glucose homeostasis. Cell Signal. 2008; 20:2180-2197.

23-  Reshef, L., Olswang, Y., Cassuto, H. et al. Glyceroneogenesis and the triglyceride/fatty acid cycle. J Biol Chem. 2003; 278:30413-30416.

24-  Scotti, E., Gilardi, F., Godio, C. et al. Bile acids and their signaling pathways: eclectic regulators of diverse cellular functions. Cell Mol Life Sci. 2007; 64:2477-2491.

25-  Staels, B., Kuipers, K. Bile acid sequestrants and the treatment of type 2

diabetes mellitus. Drugs. 2007; 67:1383-1392.

26-  Staels, B., Fonsec, V.A. Bile Acids and Metabolic Regulation. Mechanisms and clinical responses to bile acid sequestration. Diabetes Care. 2009; 32:237-S245.

27-  Stauffer, A.T., Rochat, M.K., Dick, B, Frey, F.J.; Odermat, A. Chenodeoxycholic acid and deoxycholic acid inhibit 11β-Hydroxysteroid Dehydrogenase Type 2 and cause cortisol-induced transcriptional activation of the mineralocorticoid receptor. J Bio Chem. 2002; 277:26286–26292.

28-  Swords, F.M., Aylwin, S., Perry, L. et al. The aberrant expression of the Gastric Inhibitory Polypeptide (GIP) receptor in adrenal hyperplasia: Does chronic adrenocorticotropin exposure stimulate up-regulation of GIP receptors in Cushing’s Disease? J Clin Endocrinol Metab. 2005; 90: 3009-3016.
29- Thomas, C., Pellicciari, R., Pruzanski, M., Auwerx, J., Schoonjans, K. Targeting bile acid signaling for metabolic diseases. Nat Rev Drug Discov. 2008; 7:678-693.

30- Van Raalte, D.H., Ouwens, D.M., Diamant, M. Novel insights into glucocorticoid-mediated diabetogenic effects: towards expansion of therapeutic options? Eu J Clin Invest. 2008; 39:  81-93.

31-  Xenoulis, P.G., Steiner, J.M. Lipid metabolism and hyperlipidemia in dogs.  Vet J. 2010; 183:12-21.