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agosto 2015

Análisis del uso terapéutico de anti-TNF-alfa en 3 equinos con osteoartritis crónica.

Vet. Arg. – Vol.  XXXII –  Nº  328 – Agosto 2015.
De Simone, Emilio; Perrone, Gustavo; Caggiano, Nicolás; Lastra, Yael; Rubatino, Florencia; Ferretto, Araceli; Diaz, Julieta; Chiappe Barbará, María Angelina.

Resumen
Introducción: La Osteoartritis (OA) es una enfermedad inflamatoria que evoluciona hacia la cronicidad. El TNF-α  induce liberación de MMP-2 y MMP-9, que participan de manera central en el proceso inflamatorio. La implicancia biológica del TNF-α como factor desencadenante justifica el tratamiento con un anti-TNF-α. Objetivos: Evaluar el desarrollo y uso terapéutico del anti-TNF-α en 3 casos de equinos con osteoartritis crónica. Materiales y métodos: i) Se desarrolló de suero anti-TNF-α en conejos. ii) Se trató equinos con anti-TNF-α y se evaluó el score clínico pre y post tratamiento. iii) En nuestro laboratorio se evaluó la actividad MMP, IL-1, IL-4, IL-6, TNF-α y óxido nítrico en el líquido sinovial. Resultados: En todos los casos se observó mejoría clínica y una disminución significativa, e incluso valores de cero, en los perfiles de MMPs 2 y 9. Se presentó una mejoría notable en los perfiles de TNF-α, IL-4, IL1-β e IL-6 llevando estos valores a los niveles basales considerados normales. Mientras que respecto al óxido nítrico los resultados fueron variables. Conclusiones: La terapia anti-TNF-α resultó alentadora en cuanto a que los animales tratados mejoraron su score clínico y biomarcadores moleculares articulares, permaneciendo esta mejoría  durante el tiempo de la experiencia (60 días).

Palabras clave: terapia anti-TNF-α, equinos, osteoartritis, citoquinas, metaloproteasas.

 Analysis of the therapeutic use of anti -TNF -alpha in three horses with chronic osteoarthritis.

Summary
Background: Osteoarthritis (OA) is an inflammatory disease of slow evolution to chronic nature. TNF-α induces the release of MMP-2 and MMP-9, both with a central role in the inflammatory process. The biological implications of TNF-α in the OA pathogenesis justify the treatment with an anti-TNF-α antibody. Objective: Was to evaluate the development and therapeutic potential use of anti-TNF-α in 3 cases report of the disease. Materials and methods: i) development of anti-TNF- α serum in rabbits. ii) 3 horses were treated with anti-TNF-α and treatment response was assessed with a clinical score. iii) MMP activity, IL-1, IL-4, IL-6, TNF-α and nitric oxide in synovial fluid were evaluated. Results:  the three animals improved their clinical score, and MMPs 2 and 9, TNF-α, IL-4, IL1-β and IL-6 values were significant decrease ​​to baseline normal levels. While nitric oxide results were variable. Conclusions: the anti-TNF-α treated animals improved their clinical score and joint molecular biomarkers, remaining this improvement during the time of the experiment (60 days). Keywords: anti-TNFα therapy, horses, osteoarthritis, cytokines, metalloproteinases.

Dirección postal: Cátedra de Fisiología Animal, Facultad de Ciencias Veterinarias – UBA.  Av. Chorroarín 280 – C1427CWO – Buenos Aires – Argentina.
Dirección electrónica: mach@fvet.uba.ar

Introducción.
La Osteoartritis (OA) es una enfermedad inflamatoria que evoluciona inicialmente con periodos de actividad de fase aguda produciendo, en la reincidencia, cambios degenerativos y pérdida del cartílago articular, instalándose así el cuadro en forma crónica. En el equino deportivo la OA es la principal causa de claudicación y se produce, generalmente, como consecuencia del sobre entrenamiento. Esta enfermedad produce importantes pérdidas económicas, ya que ocasiona el alejamiento temprano de la competencia deportiva en forma temporaria o definitiva (Kidd et al., 2010).

La enfermedad se inicia con la aparición de micro traumas reiterados que no se resuelven y desencadenan el proceso inflamatorio articular. El daño articular se produce como consecuencia de diversos mecanismos que se ponen en marcha en el proceso inflamatorio. El hueso subcondral subyacente participa del proceso inflamatorio mediante el incremento de la actividad resortiva osteoclástica causada por la alteración de la capacidad biomecánica del cartílago (Hulejova el al., 2007). Los condrocitos aumentan la liberación de factores catabólicos los cuales  contribuyen al daño articular y óseo (Sanchez Naranjo et al. 2011). Además, los condrocitos liberan mediadores de la inflamación tales como citoquinas, metaloproteasas (MMPs) y oxido nítrico (Attur et al., 2002) (Dean 1991). En el líquido sinovial aparecen en la fase inicial de la fisiopatología de la OA macrófagos y neutrófilos que secretan citoquinas proinflamatorias: IL-1β, TNF-α e IL-6 (Benito et al. 2005) (Bondenson et al., 2006) (Kapoor et al., 2011) (Stow et al., 2009). Las citoquinas inflamatorias inducen liberación de MMPs (Fernandes et al., 2002) (Hulejova et al., 2007) y agrecanasas (Pratta et al., 2003) (Bondenson et al., 2008) (Nagase et al., 2003), que participan de manera central en la degradación de la matriz extracelular que desencadena la destrucción del cartílago articular (Galleguillos et al 2013).

Las MMP involucradas en este proceso son proteasas que actúan sobre la matriz extracelular en procesos relacionados con el desarrollo, la regeneración y la enfermedad. Varios tipos de MMPs han sido descriptos (Massova et al., 1998) siendo la MMP-2 (72kDa) y la MMP-9 (92kDa) con actividad gelatinasa (Sternlicht et al., 2001) (Nagase et al., 1999), las que actúan sobre los productos de degradación del colágeno (Overall et al., 2007) y son las que más se han relacionado con los procesos de osteoartritis. Hasta el momento se ha asociado, de manera directa, la sobreexpresión de las MMPs con los niveles de TNF-α e IL-1β y en muchos casos también mediado este proceso por el factor NFκB (Amos et al., 2006). Asimismo la sobreexpresión de MMP-2 y 9 es índice de un pronóstico desfavorable en el cáncer, aumentando la posibilidad de generar metástasis, dada la capacidad de las MMPs de degradar el colágeno tipo IV localizado en las membranas basales e inducir la expresión de factores angiogénicos. (Cascales Angosto et al., 2010). Su actividad aumentada también se ha asociado a procesos neurodegenerativos (Moore et al., 2012).
Respecto a la citoquinas, el TNF-α es una citoquina pleotropica clave en los procesos inflamatorios y un mediador proinflamatorio que a su vez potencia todo el proceso, incrementando la permeabilidad vascular e induciendo al endotelio a expresar moléculas de adhesión que favorecen la diapédesis de leucocitos (Apostolaki et al, 2010). El TNF-α, a pesar de encontrarse incrementado en las fase muy temprana de la artritis pero en muchos casos se dificulta la instantánea detección de su actividad elevada, juega un rol central en los procesos catabólicos crónicos del cartílago (Goldring y col., 2004). El TNF-α promueve la liberación de otras pro-citoquinas inflamatorias, las interleuquinas (ILs)  IL4, IL-1β, IL6, IL8, y estimula la producción de proteasas, leucotrienos, tromboxanos, prostaglandinas y proteínas de fase aguda. La IL-1β es producida principalmente por células del linaje monocito-macrófago y además de encontrarse elevada de manera local juega un papel importante en la patogenia de la OA, se encuentra elevada de manera sistémica ocasionando fiebre hipertermia y otras respuestas. La IL-1β participa, también, en la cascada inflamatoria estimulando la síntesis de TNF-α, IL-6, IL-8, PGE2 y Leucotrieno B4. Por otra parte la IL-6 se encuentra involucrada en la degradación del cartílago articular produciendo degradación de proteoglicanos e induciendo proliferación de condrocitos (Jikko et al., 1998), además juega un rol importante en la inflamación y estimula la liberación de Proteína C reactiva (Kishimoto 2006).

Se aplican numerosos tratamientos para las OA que se basan en la utilización de antiinflamatorios esteroideos y AINES. Estos tratamientos si bien desinflaman y mejoran transitoriamente la claudicación, generan cambios metabólicos en el hueso y cartílago que llevan a un mayor deterioro de la articulación. Esto llevó a probar una nueva forma de terapia para las OA. Las terapias biológicas de anticuerpos han presentado un gran avance en la última década en el control de artritis de diferentes etiologías. Por lo tanto la posibilidad de interrumpir el ciclo inflamatorio bloqueando la actividad del TNF-α resulta una terapia sumamente alentadora por los excelentes resultados logrados. En medicina humana se ha utilizado, con éxito, la terapia con anticuerpos en diversas enfermedades reumáticas como la artritis reumatoide (Maini et al., 1999) y la espondilitis anquilosante (Braun et al., 2000 y 2002), como así también se ha usado en otras enfermedades inflamatorias del aparato digestivo como la enfermedad de Crohn y la colitis ulcerativa (Delaporte et al., 2013) (Present et al., 1999). Por otra parte han sido descriptos escasos efectos adversos como consecuencia de la terapia con anti-TNF-α entre los que se encuentran el desarrollo de inflamación leve y fenómenos de hipersensibilidad (Braun et al., 2002b). La implicancia biológica del TNF-α en las artritis y otros tipos de procesos reumáticos sugieren el potencial terapéutico de utilizar un anti-TNF-α. Sin embargo estas terapias aun no han podido ser probados en especies de interés veterinario debido al alto costo que implicaría su tratamiento.

El TNF-α soluble corresponde a una proteína de 17 KDa, conformada por 157 aminoácidos, que posee capacidad inmunogénica por lo tanto es muy posible desarrollar anticuerpos contra esta molécula al inmunizar con la misma o con péptidos relacionados. Nuestra propuesta en este trabajo ha sido desarrollar un suero anti-TNF-α en conejos y estudiar el tratamiento de inhibición del TNF-α en artritis equinas. La terapia anti-TNF-α ha resultado de utilidad en procesos diversos de inflamación articular, sobre todo aquellos procesos que tienden a la cronicidad y que afectan al cartílago y al hueso yuxtaarticular (Feldman 2001 y 2002). La terapia anti-TNF-α inhibe la producción de IL-1β y de otras citoquinas proinflamatorias cortando de esta manera una red de citoquinas inflamatorias desde el inicio e inhibiendo indirectamente la actividad de las principales MMPs involucradas.

Materiales y métodos.
1) Desarrollo de suero anti-TNF-α en conejos,  el suero anti TNF-α se desarrolló mediante inmunización de conejos con un péptido de 20 aa correspondiente al dominio de unión del TNF-α  equino a su receptor (aa 93-112). Se realizaron cuatro inmunizaciones del péptido unido a la proteína carrier KLH a los días 0, 7, 21 y 28 y posteriormente se realizó el sangrado de los conejos para extraer el suero. El suero de los conejos fue titulado por ELISA. Y luego purificadas las inmunoglobulinas mediante cromatografía de afinidad con proteína A. Asimismo se esterilizó con jeringa filtrando con filtro de  0,22 µm.

2) Administración de anti-TNF-α en equinos y evaluación de score clínico

Previo a la experiencia se seleccionaron los animales mediante un score clínico cuyo valor se calculaba con: i) Grado de claudicación (0-5) ii) Sensibilidad a la palpación (0-3), iii) Flexión forzada (0-3), iv) Volumen de líquido sinovial extraído (0-3), v) color (0-5) y vi) viscosidad (0-4).  Se seleccionaron animales con enfermedad articular no tratados (score clínico > 5). Además los animales presentaban historia de episodios recurrentes de OA y se les realizó evaluación radiográfica previa y posterior.

A los animales se les inyectó por única vez 1mg de IgG de conejo con actividad anti TNF-α por vía intraarticular.

Se tomaron muestras de líquido sinovial de ambos tarsos previo a la dosificación con anti-TNF-α y a los 30 días posteriores.

3) Análisis de la actividad MMP en zimografía con geles de poliacrilamida:

La zimografía de geles de acrilamida con el agregado de gelatina se realizó como se describiera previamente (Gruberg et al., 1996) con ligeras modificaciones  utilizando el sistema tetracell de BioRad. La concentración de acrilamida en los geles fue de 10% con el agregado de gelatina de piel porcina (Sigma) (2mg por mL de gel) y SDS al 0,1%. Antes de su aplicación, las muestras se desnaturalizan por calentamiento a 90ºC durante 4 minutos. Se realiza la corrida y los geles se lavan dos veces, durante 45 minutos, con Tris 50mM, 5 mM CaCl2, 150 mM NaCl pH 7,4, que contiene Triton X-l 00 a] 2,5% (y/y), para eliminar el SDS presente en el gel. a temperatura ambiente. A continuación el gel se incuba durante 24 horas con tampón Tris 50mM, pH 7,5, NaCí 0,1SM, CaCI2 lOmM, Triton X-l00 0,1% (y/y), NaN3 0,02% (p/v), en el cual la actividad de gelatinasa es máxima. Posteriormente, los geles se tiñen con una solución de azul de Coomassie R-250 al 0,25% (p/v) en metanol:ácido acético:agua (5:1:5;) El desteñido del gel se realiza por lavados con ácido acético al 7,5% (v/v) y metanol al 20% (v/v). La actividad gelatinolitica se detecta por la tinción negativa debido a la degradación de la gelatina presente en aquellas zonas del gel donde se localizan las metaloproteinasas. Los resultados de la actividad de MMPs se expresan como porcentaje de MMPs Standard. Las imágenes de las zimografías fueron adquiridas con cámara fotográfica Nikon coolpix L26 y el análisis densitométrico se realizó con el programa Image J. Las MMPs se expresaron como % respecto a una muestra patrón.

4) ELISA de IL-1β, IL-4, IL-6 y TNF-α La concentración de citoquinas (IL-1β, IL-4, IL-6, TNF-α) en los sobrenadantes articulares fue determinada mediante kit de ELISA comercial BD OptEIA (BD, Biosciences, San Diego, Ca, USA) siguiendo las recomendaciones del fabricante. Las concentraciones fueron determinadas mediante curva patrón correspondiente a  la respectiva citoquina recombinante que fue suministrada por el kit. Para esta determinación se utilizan 100 microlitros de líquido sinovial y anticuerpos monoclonales provistos por el kit para captura y detección. Los anticuerpos de detección son biotinilados y utilizan el sistema avidina peroxidasa con sustrato TMB (Biosciences, San Diego, Ca, USA). La placa se lee a una longitud de onda primaria de 450nm en lector de microplacas Rayto 2100C (China).

Resultados.
El resumen de los resultados se expone en la tabla 1. La terapia anti-TNF-α resultó alentadora en cuanto a que los animales que presentaron tratamiento mejoraron su score clínico a los 30 días. En cuanto a los perfiles de citoquinas y MMPs se observó mejorías manifiestas post  tratamiento a los 30 post tratamiento y se mantuvieron estas mejorías más allá de los 60 días.  En los resultados post tratamiento puede observarse un manifiesto descenso e incluso ausencia de la MMP9 que se había detectado en una articulación pretratamiento. Y en cuanto a la MMP 2 se observo descenso o valores similares si estos eran normales. Respecto a los niveles de citoquinas el resultado inhibitorio del anti-TNF-α sobre las ILs fue contundente, encontrándose valores dentro del marco normal en casi todas las muestras post tratamiento.

En cuanto a las RX no se observaron modificaciones manifiestas, ya que en general, una vez instalado el daño óseo este no se revierte rápidamente. Por todo esto el tratamiento con anti-TNF-α parece ser útil para aliviar la inflamación de tejidos blandos articulares y el dolor instalado en forma crónica.
FORO UNOTabla 1. Resultado del score clínico y los biomarcadores moleculares en el líquido sinovial de los equinos evaluados.

Conclusión
El uso de este tipo de terapias puede ser muy alentador ya que la terapia convencional con antiinflamatorios esteroideos o no esteroides reducen el dolor pero son inefectivos para controlar la actividad de la enfermedad o modificar el curso de la misma. El bloqueo de TNF-α es alentador y se ha convertido en una estrategia que hasta el momento solo ha sido eficaz mediante terapia biológica con anticuerpos.

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