Martes, 21 de mayo de 2019

MAYO de 2019
Volumen XXXVI 
N° 373
ISSN 1852-317X

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enero 2019

Estudio de la presencia de la equibactina en aislamientos locales de Streptococcus equi subsp equi  y su utilidad diagnóstica.

Vet. Arg. – Vol.  XXXVI – Nº 369 – Enero 2019.
Carla Paola Bustos1*, Caiane Tasca2, María Mesplet1, Nora Guida1, Agueda Castagna de Vargas2.

Resumen
Streptococcus equi subsp. equi (S. equi) es un coco grampositivo, β hemolítico y agente causal de la adenitis equina. S. equi afecta el tracto respiratorio alto del equino con abscedación de linfonódulos de cabeza y cuello, pudiendo permanecer en animales recuperados como portadores quienes actúan como una importante fuente de infección. Posee numerosos factores de virulencia y además, produce equibactina (Eqb) que es un sideróforo para la captación más eficiente de hierro. Eqb le permitiría proliferar en tonsilas y linfonódulos y mantenerse en las mucosas de los portadores. El diagnóstico de la adenitis equina y la detección de portadores incluye la PCR directa y el cultivo e identificación fenotípica y genotípica (genes sodA, seeI, seeH y/o seM). Recientemente, se comenzó a utilizar como diagnóstico PCR de los genes eqbG y eqbE que codifican para la Eqb. El objetivo de este trabajo fue investigar la presencia de la Eqb en aislamientos argentinos de S. equi y evaluar su utilidad en el diagnóstico de la adenitis equina y en la detección de portadores. Se estudió la presencia de la Eqb mediante la amplificación de los genes eqbG y eqbE en 29 aislamientos de S. equi, 13 de enfermos y 16 de portadores. El 100% (29/29) de los aislamientos resultaron positivos al gen eqbG y el 86% (25/29) al gen eqbE. Estos resultados fueron similares a los obtenidos en Brasil y por lo tanto, consideramos que la detección de la Eqb puede ser útil en la identificación de cepas locales de S. equi siempre que se considere la amplificación del gen eqbG ya que la utilización del gen eqbE arrojó un elevado número de falsos negativos de S. equi.
Palabras clave: Streptococcus equi subsp. equi, Adenitis equina, Diagnóstico, Portadores, Equibactina

Summary
Streptococcus equi subsp. equi (S. equi) is a β hemolytic and Gram-positive coccus that produces Strangles. S. equi affects upper respiratory tract of horses and it produces abscessation of lymph nodes of head and neck. Healthy horses recovered from Strangles might continue to harbour S.equi and may transmit the bacterium to other horses. S. equi has large virulence factors and also produces equibactin (Eqb), a siderophore that enhances its ability to acquire iron. Eqb may be related with proliferation of S. equi in tonsils and lymph nodes and the persistence of the bacterium in mucous of carrier horses. Strangles diagnosis and carrier detection are done by direct PCR and culture of the bacterium using phenotypic and genotypic identification (sodA, seeI, seeH and/or seM genes). Recently, PCR amplifying eqbG and eqbE genes, which encode Eqb, is used for S. equi identification. The aim of this work was to study the presence of Eqb in Argentine isolates of S. equi and to analyse its utility in Strangles diagnosis and carrier detection. Twenty-nine isolates (13 from sick horses and 16 from carriers) were studied by eqbG and eqbE genes amplification. One hundred percent of isolates (29/29) were positive to eqbG gene and 86% (25/29) of them were positive to eqbE gene. Similar results were obtained in Brazil, thus so we propose that the Eqb detection using eqbG gene may be useful to identify local strains of S. equi. However, eqbE was negative in a high number of S. equi isolates producing false negative results so it should not be use in local strain identification.
Keywords: Streptococcus equi subsp. equi, Strangles, Diagnosis, Carriers, Equibactin.
1Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Veterinarias, Cátedra de Enfermedades Infecciosas, Argentina.

2Universidad Federal de Santa María, Laboratorio de Bacteriología (LABAC), Río Grande do Sul, Brasil.
carlabustos@fvet.uba.ar

 Introducción
Streptococcus equi subsp. equi (S. equi) es un coco grampositivo, β hemolítico del grupo C de Lancefield, agente causal de la adenitis equina. Esta enfermedad se caracteriza por afectar el tracto respiratorio alto de equinos jóvenes produciendo rinitis, faringitis y linfoadenitis de cabeza y cuello (Sellon, 2013; Waller, 2013). Aproximadamente el 10% de los animales recuperados de la enfermedad pueden permanecer como portadores de S. equi siendo una importante fuente de infección para otros animales susceptibles (Newton, 2000; Chanter, 2000.
S.equi posee numerosos factores de virulencia entre los que se destacan la cápsula de ácido hialurónico, la proteína M (SeM), los superantígenos SeeI, SeeH, SeeL y SeeM y, diversas enzimas como la estreptolisina y la estreptoquinasa (Waller, 2011; Paillot, 2010; Timoney, 2004). Además, produce un sideróforo llamado equibactina (Eqb) que tiene la habilidad de captar el hierro in vitro (Cordoni, 2015; Waller, 2011). Se cree que la captación más eficiente de hierro le permite a la bacteria proliferar en tonsilas y linfonódulos (ln) aumentando su capacidad de formar abscesos y sería fundamental para mantenerse en las mucosas de los animales portadores (Waller, 2011).

El diagnóstico de la adenitis equina se basa en la signología de los equinos, la presentación en forma de brote y se confirma con el aislamiento de la bacteria a partir de los ln abscedados y/o de las secreciones nasales purulentas (Bustos, 2016; Waller, 2013; Timoney, 2004). También se puede realizar la detección del microorganismo a través de PCR directa (a punto final o en tiempo real), que posee mayor sensibilidad que el cultivo (Cordoni, 2015; Waller, 2013; Webb, 2013). Sin embargo, la PCR directa no permite distinguir entre bacterias viables o muertas y además, tampoco permite el estudio genotípico ni del perfil de susceptibilidad antimicrobiana de los aislamientos, ni la utilización de la cepa en el desarrollo de inmunógenos autólogos (comunicación personal). Por otro lado, el diagnóstico de los caballos portadores se realiza a partir del cultivo o PCR directa de muestras obtenidas idealmente de las bolsas guturales o de la nasofaringe donde la bacteria se encuentra de manera intermitente (Bustos, 2012a; Newton, 2000; Chanter, 2000; Chanter, 1997).

La posterior identificación de genes específicos de S. equi, como sodA, seeI, seeH y/o seM, entre otros, por medio de la técnica de PCR, permite su diferenciación con otra bacteria estrechamente relacionada: Streptococcus equi subsp. zooepidemicus (S. zooepidemicus) (Bustos, 2016; Cordoni, 2015; North, 2014; Waller, 2013; Webb, 2013). Estos dos microorganismos poseen un 98% de homología genética pero se comportan de manera diferente ya que S. equi es un patógeno primario adaptado al equino y S. zooepidemicus es un comensal de mucosas que puede generar infecciones secundarias en diversas especies animales (Waller, 2011; Timoney, 2004). Recientemente se han comenzado a utilizar los genes que codifican para la Eqb como targets para el diagnóstico por PCR. La amplificación de los genes eqbG y eqbE fue probada por Cordoni et al. (2015) y Webb et al. (2013), respectivamente, mostrando valores de sensibilidad y especificidad elevados.

El objetivo de este trabajo fue investigar la presencia de la Eqb en aislamientos argentinos de S. equi y evaluar su utilidad en el diagnóstico de la adenitis equina y en la detección de portadores.

Material y métodos
Se estudiaron 29 aislamientos de S. equi, 13 provenientes de animales enfermos (10 de linfoadenitis submandibular y 3 de empiema de bolsas guturales) y 16 de animales clínicamente sanos considerados portadores.

Se estudió la presencia de la Eqb mediante la amplificación de una región de 201 pb del gen eqbG y una región de 1063 pb del gen eqbE utilizando los primers descriptos en la tabla 1.

Tabla 1: Primers, secuencias y tamaño de los segmentos de los genes eqbG y eqbE amplificados en los aislamientos de S. equi estudiados.

Las reacciones de PCR se realizaron con un volumen final de 25 µL conteniendo 5µL de Buffer 5x GoTaq (Promega), 10mM de cada primer, 20mM de cada desoxinucleótido trifosfato (dNTP), 1UI of GoTaq DNA Polimerasa, 1µL de templado (≅100 ng de ADN) y agua libre de DNAsas y RNAsas. Se utilizó como control positivo a la cepa de referencia ATCC®39506 de S. equi y como control negativo agua ultrapura.

Los productos amplificados fueron corridos electroforéticamente en gel de agarosa al 1,5% y observados luego de la tinción con GelRed™ (Biotium-Uniscience) a través de un transiluminador con luz U.V.

Resultados
Todos los aislamientos estudiados resultaron positivos a la PCR amplificando el gen eqbG y 25 de ellos fueron positivos para el gen eqbE (Figuras 1 y 2).

Figura 1. Electroforesis en gel de agarosa 1.5% del segmento de 201 pb del gen eqbG. MM: marcador de peso molecular. Calles 1-15: aislamientos de S. equi positivos. C+: control positivo. C-: control negativo.

Figura 2. Electroforesis en gel de agarosa 1.5% del segmento de 1063 pb del gen eqbE. MM: marcador de peso molecular. Calles 1, 5-7, 9-14: aislamientos de S. equi positivos. Calles 2-4, 8: aislamientos de S. equi negativos. C+: control positivo. C-: control negativo.

Los resultados de las PCR amplificando cada gen en los aislamientos se detallan en la tabla 2.

Tabla 2: Resultados de las PCR amplificando los genes eqbG y eqbE en los aislamientos de S. equi estudiados.

Discusión
Se logró detectar la presencia  del gen eqbG en el 100% (29/29) de los aislamientos de S. equi y el 86% (25/29) de ellos resultaron positivos a la PCR para el gen eqbE. De los 4 aislamientos que resultaron negativos, uno correspondía a un caballo con empiema de bolsas guturales y los otros fueron obtenidos de ln de 3 equinos con sintomatología de adenitis equina. De manera similar, en estudios realizados con aislamientos brasileños, se obtuvo un 100% de aislamientos positivas al gen eqbG y sólo un 66% (40/60) al gen eqbE. Ninguno de los aislamientos brasileños de caballos portadores fue positivo al gen eqbE (Tasca, 2018), a diferencia del presente estudio, donde todos los aislamientos de portadores amplificaron ambos genes. El 95,24% (40/42) de aislamientos provenientes de animales enfermos en Brasil resultaron positivos al gen eqbE mientras que sólo el 69,23% (9/13) de los aislamientos de enfermos en Argentina presentaron dicho gen. Estas diferencias podrían deberse a la presencia de otros factores de virulencia presentes en las cepas aisladas de enfermos que permiten a la bacteria producir lesiones y enfermar a los animales estudiados.

Por otro lado, es interesante destacar que se obtuvieron diferencias en 3 aislamientos aislados de la misma muestra de empiema de bolsas guturales de un equino adulto: UBA8Ch y UBA8Md fueron positivos tanto a eqbG como a eqbE pero UBA8Gd fue sólo positivo a eqbG. Además, en estudios previos de estos aislamientos observamos diferencias en cuanto a su susceptibilidad antimicrobiana, nivel de expresión de cápsula y formación de biofilm (Bustos, 2016; Bustos, 2012b). Webb et al. (2013) también reportaron 2 aislamientos de S. equi negativos a eqbE procedentes de bolsas guturales de 2 equinos pertenecientes al mismo establecimiento. Estos resultados podrían estar indicando cierto grado de atenuación de las cepas alojadas en las bolsas guturales como ha sido descripto previamente por otros investigadores que identificaron la SeM truncada y la pérdida de genes de numerosos aislamientos de S. equi de portadores (Harris, 2015; Webb, 2013; Chanter, 2000).

Con base en los resultados obtenidos en el estudio de aislamientos argentinos y brasileños, la detección de la Eqb puede ser útil en la identificación de cepas locales de S. equi siempre que se considere la amplificación del gen eqbG. No recomendamos utilizar la PCR amplificando el gen eqbE para diagnosticar adenitis equina ya que el 30,77% de las cepas aisladas de enfermos en Argentina resultó negativo; ni para detectar portadores ya que el 100% de las cepas aisladas de portadores en el sur de Brasil estudiadas no amplificaron ese gen y por lo tanto arrojaron un elevado número de falsos negativos de S. equi.

La expansión clonal de los aislamientos de S. equi con pérdidas de genes enfatiza la importancia de incluir más de un gen target para la identificación por PCR y así disminuir los falsos negativos en el diagnóstico de adenitis equina y principalmente, en la detección de portadores. Se propone entonces, aumentar el número de aislamientos de S. equi a analizar para conocer la prevalencia de estos genes en los aislamientos locales y la utilidad diagnóstica de las PCR amplificando los genes eqbG y eqbE.

Conclusiones
Según los hallazgos obtenidos, la PCR utilizando el gen eqbG podría ser útil para la identificación de aislamientos locales de S. equi. El gen eqbE no sería adecuado para el diagnóstico de la adenitis equina ni para la detección de portadores de la enfermedad.

Agradecimientos
Este trabajo fue realizado en el marco de la Movilidad Docente 2017 de la Asociación de Universidades del Grupo Montevideo (AUGM) de la Dra. Carla Bustos y financiado por los Proyectos de Investigación UBACyT 20020130100299BA (Dir. Dra. Nora Guida y codir. Dra. María Mesplet) y UFSM044905 (Dir. Dra. Águeda Castagna de Vargas). Caiane Tasca fue becaria de Maestría UFSM 2016-2018 y Carla Bustos fue Becaria Postdoctoral CONICET 2016-2018.

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