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marzo 2022

Sensibilidad antibiótica de bacterias gram negativas aisladas de leche de cabras.

Vet. Arg. – Vol.  XXXIX – Nº 407 – Marzo 2022.
Carlos Bedolla Cedeño1, Rosalva Mejía Alfaro1, Alejandro Córdova Izquierdo2

Resumen
El objetivo del presente trabajo fue identificar las bacterias Gram negativas aisladas de leche de cabras en el municipio de Yurécuaro, Michoacán. El estudio se realizó durante el periodo de Agosto 2016 a Enero 2017,  en el Municipio de Yurécuaro, Michoacán, con 25 hatos de cabras lecheras de la raza Sannen, explotados a pequeña escala bajo un sistema de producción semi-intensivo. Se recolectó una muestra de leche de los botes de recepción de cada unidad de producción en tubos de ensayo esterilizados con tapón hermético los cuales fueron previamente identificados con la información del establo. Los tubos de muestra se colocaron dentro de una hielera cerrada herméticamente para posteriormente transportarlas al área de bacteriología de la USAD de la Facultad de Medicina Veterinaria y Zootecnia para su procesamiento inmediato. Se identificaron  34 cepas de  micoorganismos etiológicos Gram-negativos causales de mastitis con una frecuencia de 38.23%  para Enterobacter cloacae, 29.41 % a  Citrobacter freundii, 20.58 % a Alcaligenes faecalis, 11.76% a Serratia spp.  y  2 .9% a Citrobacter diversus. La presencia de este tipo de microorganismos constituye una evidencia del inadecuado manejo higiénico sanitario de la unidad de producción y de la leche. El análisis de comportamiento de las cepas Gram-negativas aisladas frente a los antimicrobianos de uso frecuente en el tratamiento de mastitis, mostro que la resistencia encontrada a Ampicilina fue de 73.52 %,  Cefalotina  64.7 %, Nitrofurantoina  26.47%, Carbenicilina 17.64 %, Cefotaxima 11.76 %, Trimetropin-sufametoxazol  11.76 %, Cloranfenicol 5.8 % y Ceftriaxona 2.9%. Lo anterior puede deberse a que la Ampicilina es uno de los antibióticos que se utiliza con mayor frecuencia en el tratamiento de estos patógenos. Se concluye que el 100 % de las cepas  Gram-negativas identificadas en este estudio presentan  sensibilidad a Amikacina, Gentamicina, Netilmicina y Pefloxacina.

Palabras clave: Cepas; Enterobacter cloacae; Citrobacter freundii

Antibiotic sensitivity of gram negative bacteria isolated from goat milk.
Summary
The objective of the present work was to identify Gram negative bacteria isolated from goat milk in the municipality of Yurécuaro, Michoacán. The study was conducted during the period from August 2016 to January 2017, in the Municipality of Yurécuaro, Michoacán, with 25 herds of dairy goats of the Sannen breed, exploited on a small scale under a semi-intensive production system. A milk sample was collected from the receiving cans of each production unit in sealed sterilized test tubes which were previously identified with the barn information. The sample tubes were placed inside a hermetically sealed cooler and then transported to the bacteriology area of ​​the USAD of the Faculty of Veterinary Medicine and Zootechnics for immediate processing. Thirty-four strains of Gram-negative etiological causative organisms of mastitis were identified with a frequency of 38.23% for Enterobacter cloacae, 29.41% for Citrobacter freundii, 20.58% for Alcaligenes faecalis, 11.76% for Serratia spp. and 2 .9% to Citrobacter diversus. The presence of this type of microorganisms is evidence of inadequate hygienic health management of the production unit and milk. The analysis of the behavior of the isolated Gram-negative strains against the antimicrobials frequently used in the treatment of mastitis, showed that the resistance found to Ampicillin was 73.52%, Cefalotin 64.7%, Nitrofurantoin 26.47%, Carbenicillin 17.64%, Cefotaxima 11.76 %, Trimetropin-sufamethoxazole 11.76%, Chloramphenicol 5.8% and Ceftriaxone 2.9%. The above may be due to the fact that Ampicillin is one of the antibiotics that is used most frequently in the treatment of these pathogens. It is concluded that 100% of the Gram-negative strains identified in this study have sensitivity to Amikacin, Gentamicin, Netilmicin and Pefloxacin.
Keywords: Strains; Enterobacter cloacae; Citrobacter freundii
1Facultad de Medicina Veterinaria y Zootecnia. Universidad Michoacana de San Nicolás de Hidalgo. Michoacán, México.
2Departamento de Producción Animal. Universidad Autónoma Metropolitana. Xochimilco. Ciudad de México. México.
Correspondencia: Dr. Alejandro Córdova Izquierdo acordova@correo.xoc.uam.mx

Introducción
La mastitis caprina es una de las enfermedades infecciosas más importantes en el rebaño lechero a nivel mundial, provocando una disminución tanto en la calidad, como en cantidad de la leche producida, lo que genera pérdidas económicas considerables. Su complejidad se debe a los numerosos y variados agentes patógenos que pueden causarla (Staphylococcus aureus, Streptococcus agalactiae, Mycoplasma sp, Streptococcus dysgalactiae, Streptococcus uberis, Streptococcus faecalis, Estafilococos Coagulasa Negativos, la variedad y magnitud de la respuesta que puede producirse en el animal infectado, los múltiples factores que influyen en su ocurrencia y los resultados encontrados en las medidas de control (1).

La mastitis se reconoce como una infamación de la glándula mamaria,  usualmente inducida por una infección bacteriana inflamatoria que, además, puede ser causada por agentes fúngicos, virales o por daños de tipo traumáticos térmico o químico (5). La respuesta inflamatoria intenta destruir o neutralizar el agente ofensivo, reparar los tejidos dañados y retornar la glándula a su función normal (4).

Las bacterias causantes de mastitis pueden dividirse en:

  1. Patógenos mayores. Los más comunes son Aureus y Strep. agalactie, en donde la fuente de contagio es la propia glándula mamaria y puede ser también la mano del ordeñador. Las bacterias ambientales son Strep. uberis, Strp. Dysgalactie y en menor proporción Strep, equinus. En cuanto a las colifprmes se encuentran Escherichia coli, Kebsiella spp y Enterobacter spp.
  2. Patógenos menores. Son aquellos que normalmente producen mastitis sbclínica y en raras ocasiones mastitis clínica los que residen en la piel del pezón, tienen la habilidad de provocar una inflamación a través de una infección ascendente por el conducto del pezón, el spp, y el Staph. coagulasa negativo SCN son las bacterias oportunistas más comunes.
  3. Patógenos poco comunes. Existen otra bacterias que causan mastitis severa de manera esporádica y generalmente afectan a una vaca o pocas del hato, podemos mencionar a Nocardia asteroides, N. brasiliensis, N. jorunica, Pasterella multocida, Campilobacter jejuni,B. circus y otras bacteriaas Gram negativas como Citrobacter spp., Enterobacter faecalis, Enterococcus faecium, Proteus spp., Pseudomonas aeruginosa y Serratia spp. La habilidad de estas bacterias es el medio ambiente en donde se encuentran las vacas, la principal fuente de infección es el ambiente al animal, por el manejo inadecuado de las instalaciones y la falta de higiene.

En el manejo integral de la mastitis se incluye el uso de antimicrobianos, administrados por vía sistémica e intramamaria. Dentro de los grupos  farmacológicos más  utilizados destacan los betalactáminos, macrólidos y algunos aminos glucósidos (8). La susceptibilidad de los microorganismos frente a los antimicrobianos varía de una región a otra, lo que obliga a los investigadores a realizar estudios epidemiológicos para establecer la presencia de enfermedad y sus agentes causales, así como, realizar estudios in vitro de manera periódica para determinar la sensibilidad y el estado de resistencia de los mismos (8).

En la mastitis causada por bacterias Gram negativas se ha demostrado la poca o nula utilidad de antimicrobianos. Existen explicaciones farmacocinéticas que explican porque los aminoglicosidos (quizá exceptuando la Kanamicina) no tienen utilidad en la terapia de la mastitis, en general cuando se aplica por vía parenteral, dado que no alcanzan las concentraciones terapéuticas en el tejido problema, muchos otros fármacos como la oxitetraciclina, el tianfenicol deben aplicarse por vía IV para que alcancen concentración terapéutica en dicho tejido. No debe perderse de vista la perspectiva de que las causas tanto de los éxitos como de las fallas en el tratamiento contra la mastitis por enterobacterias no están bien definida.

El objetivo de la presente investigación consistió en identificar las bacterias Gram negativas presentes en leche de cabras, así como,  determinar su sensibilidad antimicrobiana.

Material y métodos
El presente estudio se realizó durante el periodo de Agosto 2016 a Enero 2017,  en el Municipio de Yurécuaro, Michoacán. Que cuenta con una superficie de 173.88Km² y representa el 0.29 por ciento del total del Estado. Con una altitud sobre el nivel del mar de 1530 metros. Su clima es templado con lluvias en verano. La precipitación pluvial anual es de 700 milímetros con temperaturas mínima de 13°C y de 38°C en verano (6). Las muestras se recolectaron en  el municipio de Yurécuaro, Michoacán.

El estudio se realizó en 25 hatos de cabras lecheras de la raza Sannen, explotados a pequeña escala bajo un sistema de producción semi-intensivo.

El número de unidades de muestreo (n=25 establos) se calculó con un modelo aleatorio con distribución proporcional en función de la caracterización del sistema de lechería a pequeña escala. El muestreo al interior de los hatos fue por conglomerado, es decir, se tomaron una muestra de leche de los botes de recepción de cada unidad de producción.

Para la toma de muestras de leche, se utilizaron tubos de ensayo esterilizados con tapón hermético en los cuales previamente  se identificación con la información del establo. La toma de muestra se hizo directamente de los botes de almacenamiento de leche. El tubo de muestra fue llenado con los dos tercios como máximo, y fueron  colocaron dentro de una hielera  que contiene hielo seco que permite mantener las muestras en óptimas condiciones, esta debe cerrar herméticamente para proceder a transportarlas  al área de bacteriología de la USAD de la Facultad de Medicina Veterinaria y Zootecnia para su procesamiento inmediato o refrigeración  a 4°C (9).

Las muestras de leche se procesaron al siguiente día de su recolección. Las muestras fueron sembradas en placas de agar 110,  agar sangre con azida y agar Mc Conkey las cuales son llevadas a una estufa de cultivo para incubarse a 37ºC  por 24 horas, se hace la revisión de las mismas y de no haber desarrollo se incuban otras 24 horas. Para la identificación del desarrollo de las colonias que hayan crecido en las  muestra debemos observar la morfología colonial; esta se refiere al color, forma, tamaño y consistencia del desarrollo de cada uno de los medios sembrados. Se debe conocer la morfología microscópica del desarrollo, para lo cual se hizo  un frotis y tiñó  con la técnica Gram.

A los aislamientos desarrollados en las placas de agar Mc Conkey, se les realizaron las pruebas bioquímicas correspondientes para su identificación. Las pruebas utilizadas fueron: Agar- Hierro- Triple Azúcar, Urea, Citrato de Simons,  Fenil- alanina (PD), medio SIM, Gelatina nutritiva y Caldo MR/PV (rojo de metilo/ Voges-Proskauer). La interpretación de las pruebas bioquímicas en las tablas de bacteriología nos permite identificar a las bacterias Gram-negativas en género y especie.

Antibiograma
De las bacterias identificadas se sembraron los antibiogramas, se utiliso el método de difusión de Kirby-bauuer, el cual consiste en inocular  placas Petri con Agar Mueller-Hilton con la cepa suspendida en 2 ml de solución salina estéril, se hace una siembra en toda la superficie del medio y se coloca el multidisco que contiene los siguientes antibióticos: Cefalotina (CF) (30 µg), Cloranfenicol (CL) (30 µg), Ceftriaxona (CRO) 30 (µg), Ampicilina (AM) (10 µg), Amikacina (AK)(30 µg), Sulfametoxazol-trimetropin (SXT) (25 µg), Cefotaxima (CTX) (30 µg), Gentamicina (GE) (10 µg), Netilmicina (NET) (30 µg), Pefloxacina (PEF) (5 µg), Carbenicilina (CB) (100µg) y Nitrofurantoina (NF) (300 µg). Se lleva a incubar a 37°C durante 18-24 horas.

Resultados y discusión
Se recolectaron 25 muestras del bote de recepción de igual número de hatos de cabras lecheras, de los cuales se aislaron un total de 34 cepas bacterianas (100%) de microorganismos Gram-negativos (Cuadro 1).

 Cuadro 1. Microorganismos Gram-negativos aislados de muestras de leche del bote de recepción de los hatos caprinos del municipio de Yurécuaro, Michoacán.

Fuente: investigación directa, 2016

Los resultados del análisis bacteriológico de las muestras de leche obtenidas en este estudio se muestran en el (Cuadro 1), Se identificaron 34 cepas de  micoorganismos etiológicos Gram-negativos causales de mastitis con una frecuencia de 38.23%  que corresponde a Enterobacter cloacae, 29.41 % a  Citrobacter freundii, 20.58 % a Alcaligenes faecalis, 11.76% a Serratia spp.  y  2.9% a Citrobacter diversus.

La presencia de este tipo de microorganismos constituye una evidencia del inadecuado manejo higiénico sanitario de la unidad de producción y la leche, además de ser indicativo de la probable presencia de cepas patógenas.

Finalmente cabe mencionar que en un estudio realizado por Leitner et al. (7), éstos afirman que el origen de la infección intramamaria en cabras ha sido estudiado muy poco, pero es comúnmente reconocido que muchas de las infecciones bacterianas ocurren durante el ordeño, asimismo, por lo que la  de un tratamiento preventivo durante el período seco debería ser considerado como una medida eficaz para reducir el número de infecciones intramamarias.

Se determinó la sensibilidad antimicrobiana de las 34 cepas de microorganismos etiológicos Gram-negativos, aislados de las 25 muestras recolectadas del bote de recepción de igual número de hatos de cabras lecheras del Municipio de Yurécuaro, Michoacán (Cuadro 2).

Cuadro 2. Sensibilidad antimicrobiana de Enterobacter cloacae, Citrobacter freundii, Alcaligenes faecalis , Serratia sp y  Citrobacter diversus aislados de muestras de leche del bote de recepción de los hatos caprinos del municipio de Yurécuaro, Michoacán.


Fuente: investigación directa 2016.

El análisis de comportamiento de las cepas Gram-negativas aisladas frente a los antimicrobianos de uso frecuente en el tratamiento de mastitis, mostro que la resistencia encontrada para la Ampicilina fue de 73.52 %,  Cefalotina de 64.7 %, Nitrofurantoina de 26.47%, Carbenicilina 17.64 %, Cefotaxima 11.76 %, Trimetropin-sufametoxazol 11.76 %, Cloranfenicol 5.8 % y Ceftriaxona 2.9%.

Lo anterior pude deberse a que la Ampicilina es uno de los antibióticos que se utiliza con mayor frecuencia en el tratamiento de estos patógenos, su uso se hace de manera indiscriminada por parte de los productores y veterinarios.

Conclusión e implicaciones
El 100 % de las cepas  Gram-negativas identificadas en este estudio presentan  sensibilidad a Amikacina, Gentamicina, Netilmicina y Pefloxacina. La información obtenida aporta datos relevantes como consecuencia del escaso número de trabajos realizados en nuestro país sobre estudios de leche de cabra del bote contenedor. Por ello existe el riesgo latente en la población de enfermarse por el consumo de productos lácteos elaborados a partir de leche contaminada, los cuales pueden contener bacterias resistentes a los antibióticos y ser trasmitidos al hombre durante su consumo.

Bibliografía
[1] AIRES, DE S.M., PARENTE, C.E.S.R., VIEIRA, DA M.O, BONNA, I.C.F., SILVA D.A.,  LENCASTRE, H. Characterization of Staphylococcus aureus Isolates from Buffalo, Bovine, Ovine, and Caprine Milk Samples Collected in Rio de Janeiro State, Brazil. Applied and environmental microbiology. 73(12): 3845-3849. 2007.

[2] BEDOLLA, C.C., CASTAÑEDA, H., VELÁZQUEZ, V., CASTAÑEDA, M., BEDOLLA, E., KLOPPERT, B., WOLTER, WILFRIED. La Mastitis Caprina. Talleres gráficos de Groppe Libros. Guadalajara, México. 93 pp.2015.

[3] FERGUSON J, AZZARO G, GAMBINA M, LICITRA G. Prevalence of mastitis Pathogens in Ragusa Sicily from 2000 to 2006. J. Diary Sci 90:5798-5813. 2007.

[4] GONZÁLEZ RN. Mastitis y otros factores que afectan la calidad de leche. En: Mem Congreso Nacional de Calidad de Leche y Mastitis. Ecuador Universidad Nacional de Rio Cuatro. 1996.

[5] INEGI. (Instituto Nacional de Estadística Geográfica e Informática). Anuario Estadístico del Estado de Michoacán. Censo General de Población y Vivienda. 2002.

[6] LEITNER, G., MERIN, U. Y LAVI, A. EGBER AND N. SILANIKOVE. Aetiology of intramammary infection and its effect on milk composition in goat flocks. J. of Dairy Res. Vol. 74: 186193. 2007.

[7] MARTÍNEZ D, CRUZ A, MORENO G. Resistencia de las bacterias causantes de mastitis frente a los antimicrobianos más frecuentes. Conexión Agropecuaria JDC 3(1): 53-73. 2013.

[8] WOLTER, W., CASTAÑEDA, H., KLOPPERT, B., ZSCHÖCK, M. Mastitis bovina. Prevención diagnóstico y tratamiento. Editorial Universitaria. Universidad de Guadalajara. México. 146 pp. 2004.