Vet. Arg. - Vol. XXX - Nº 304 - Agosto 2013.
Pereira, Marcela¹; Nosach, Nancy; Fidanza, Mercedes¹; Mantica, Florencia¹; Maubecin, Elsa¹; Mira, Graciela¹; Marquez, Adrián¹

Resumen:
El cáncer de mama representa en caninos el 42% de todos los tumores en esa especie y el 82% de los tumores que afectan los órganos reproductivos. Es una enfermedad heterogénea y, por tanto, susceptible de un tratamiento diferente en cada paciente. La elección de la modalidad terapéutica más conveniente en cada caso se basa en el estudio de los factores pronósticos. Se consideran factores pronósticos en relación al tumor el tamaño tumoral, linfonódulos comprometidos, presencia de metástasis, el tipo y grado histológico y el grado de diferenciación nuclear. Tanto en Medicina Humana como en Medicina Veterinaria cobran importancia pronóstica la evaluación del estado de los receptores para estrógenos (RE) y progesterona (RP), la sobreexpresión del c-erbB-2, el estado del p53, la evidencia histológica de invasión vascular y los parámetros cuantitativos de angiogénesis. Así la presencia de los receptores hormonales (RE-RP) se asocia a mayor supervivencia y menores posibilidades de recidivas. Los marcadores que indican proliferación celular que se expresan durante el ciclo celular como el antígeno Ki67 tienen utilidad pronóstica en el cáncer mamario. En Medicina Humana altos porcentajes de Ki-67 se correlacionan con el grado de diferenciación histológica, invasión vascular, posibilidad de metástasis, recurrencia temprana y pobre sobrevida y se correlaciona inversamente con la presencia de receptores hormonales. La evaluación de estos factores pronósticos y su posterior incorporación a los estudios realizados a los pacientes caninos con cáncer mamario permitirá adecuar la terapéutica a emplear en cada caso tendiendo a incrementar la sobrevida global y la sobrevida libre de recaídas, permitirá el seguimiento de la reacción al tratamiento y la objetivación de la progresión de la enfermedad tendiendo a la mejor calidad de vida.

Palabras clave: Ki-67, factores pronósticos, tumores mamarios caninos.

Immunohistochemical detection of Ki-67 anigen in canine mammary tumors: its implicancy in the survival and its correlation with other prognostic factors.

Summary:
Canine mammary neoplasms are 42% of all canine tumors and they are 82% of tumors that affect the reproductive organs. It is a heterogeneous illness and it has different treatment in each patient. The election of it depend the study of prognostic factors. Tumor size, lymphonode involvement, presence of metastasis, histologic type and grade, degree of nuclear differentiation are prognostic factor in relationship with the tumor. In Human and Veterinary Medicine the evaluation of steroid receptor (ER-PR), c-erbB-2 overexpression, p53 status, evidence of histologic vascular invation and the angiogenesis quantitatives parameters can be used as prognostic factors. The presence of steroid receptor (ER-PR) may be associated with better survival and less chance of recurrence. The cell proliferation markers as Ki67 antigen can be used as prognostic factor in mammary tumors. In Human Medicine high percentages of Ki-67 correlated with the degree of histological differentiation, vascular invasion, possibility of metastasis, early recurrence and poor survival and correlates inversely with the presence of hormone receptors. The prognostic factors evaluation and the incorporation of the studies of the canine patients with mammary tumors will allow to adapt the therapy to use in each case. It will allow to increase the global survival and the free relapse survival time, treatment response evaluation, illness progression looking for the best quality of life.

Key words: Ki-67, prognostic factors, canine mammary tumors.

Proyecto subsidiado por UBACyT (CV07)
¹Cátedra de Patología Clínica y Enfermedades Médicas, Facultad de Ciencias Veterinarias, UBA. Chorroarín 280. C 1427. Ciudad Autónoma de Buenos Aires, Argentina. [email protected]

Introducción:
El cáncer de mama representa en caninos el 42% de todos los tumores en esa especie y el 82% de los tumores que afectan los órganos reproductivos. El cáncer mamario es una enfermedad heterogénea con un tratamiento diferente para cada paciente. La elección de la modalidad terapéutica más conveniente en cada caso se basa en el estudio de los factores pronósticos, es decir aquellas variables que relacionadas con el paciente, con el tumor o con el tratamiento, influyen de forma independiente sobre la evolución de la enfermedad y en la supervivencia total, en el tiempo libre de recaída y en la respuesta al tratamiento. En Medicina Humana existe acuerdo en considerar validados como factores pronósticos en relación al tumor el estado ganglionar, presencia de metástasis, el tamaño tumoral, el tipo y grado histológico, el grado de diferenciación nuclear. Del mismo modo en Medicina Veterinaria los estudios histopatológicos dan cuenta del grado de infiltración y el grado histológico de malignidad que incluye el grado de diferenciación o grado de anaplasia definida por la apariencia nuclear y el grado de formación tubular y el índice mitótico (IM) como el número de figuras mitóticas, entre otros.^{(1,2,4,5,6,9,11,12)} Si bien estos factores son utilizados como de rutina para indicar malignidad y el alto riesgo de recurrencia y metástasis, en Medicina Humana en la última década se han producido grandes avances, desarrollando nuevas técnicas de investigación y se han descubierto un gran número de macromoléculas importantes en los procesos biológicos. El uso de anticuerpos monoclonales permite su detección en cortes tisulares por técnicas inmunohistoquímicas al mismo tiempo que permite evaluar a la misma célula en el contexto del tejido comprometido. ^{(1,2,4,5,6,9,11,12)} Muchos investigadores han aplicado estos avances a la medición de biomarcadores en tejidos, células y fluidos, evaluación del estado de los receptores hormonales (RE-RP), la sobreexpresión del c-erbB-2, el estado del p53, la evidencia histológica de invasión vascular y los parámetros cuantitativos de angiogénesis.^(1,7,11) Estos han sido extensamente estudiados clínica y biológicamente aunque todavía no tienen un papel establecido en el manejo de los pacientes. El estado de los receptores hormonales (RE y RP) en Medicina Humana identifica a aquellos pacientes que podrán beneficiarse con la terapia adyuvante endocrina. Su presencia se asocia a mayor supervivencia y menores posibilidades de recidivas.^(5,6,8,10) En Medicina Veterinaria el 80% de los tumores mamarios caninos expresan ER, PR o ambos. Según la bibliografía consultada los tumores malignos tienen una expresión más baja de ER con respecto a los tumores benignos y los bajos niveles de ER en tumores malignos primarios se asociaron con ocurrencias de metástasis. ^(5,6,8,10) Marcadores que indican proliferación celular, que se expresan durante el ciclo celular, tienen utilidad pronóstica en el cáncer mamario canino del mismo modo que en Medicina Humana.^(1,2,6,9,13) Así Ki-67 es una proteína nuclear que se expresa en las células que se encuentran en las fases proliferativas del ciclo celular (G1, S, G2 y M). No reconoce células en la etapa de descanso (G₀). La tinción más intensa para Ki-67 se encuentra en la fase G2 y M. En Medicina Humana altos porcentajes de Ki-67 se correlacionan con el grado de diferenciación histológica, invasión vascular, posibilidad de metástasis, recurrencia temprana y pobre sobrevida y se correlaciona inversamente con la presencia de receptores hormonales.^(1,2,6,9,13) La evaluación de estos factores pronósticos y su posterior incorporación a los estudios realizados a los pacientes caninos con cáncer mamario permitirá adecuar la terapéutica a emplear en cada caso tendiendo a incrementar la sobrevida global y la sobrevida libre de recaídas, permitirá el seguimiento de la reacción al tratamiento y la objetivación de la progresión de la enfermedad tendiendo a la mejor calidad de vida. El objetivo del presente trabajo es investigar la distribución de antígeno Ki-67 como factor pronóstico en tumores mamarios caninos (benignos/malignos) y su correlación con otros factores pronósticos como el índice mitótico y el grado de anaplasia que dan cuenta del grado tumoral y la presencia o ausencia de receptores hormonales para estrógeno y progesterona.

Materiales y métodos:

Muestras:
Se trabajó con 46 muestras de tejido neoplásico mamario canino, provenientes del Servicio de Histopatología de la Facultad de Medicina Veterinaria de la Universidad de Buenos Aires.

Histopatología:
Las muestras fueron fijadas en formalina bufferada al 10% y procesadas por el método histológico convencional, que consiste en la deshidratación en alcoholes ascendentes y su inclusión en parafina. Posteriormente los cortes de 5 µm, se tiñeron con Hematoxilina-Eosina. Se evaluó el grado de anaplasia celular y el índice mitótico. El grado de anaplasia celular se definió a través de la apariencia nuclear y el grado de formación tubular y el índice mitótico se midió como el número de figuras mitóticas en metafase, telofase y anafase, descartando las células hipercrómicas o apoptóticas tomando siempre las áreas más celulares y de mayor actividad mitótica, en diez campos ópticos de alto aumento.

Inmunohistoquímica:
Se utilizaron los siguientes anticuerpos monoclonales:
Anticuerpo monoclonal de ratón anti-Ki67 (clon SP6, Cell Marque, Rockling, CA, USA.)
Anticuerpo monoclonal de conejo anti-Receptor de estrógeno (RE clon SP1, Cell Marque, Rockling, CA, USA.)
Anticuerpo monoclonal de conejo anti-receptor de progesterona (RP clon Y85, Cell Marque, Rockling, CA, USA.).

En primer lugar, las secciones de tejido fueron desparafinadas y rehidratadas. Para la recuperación antigénica se utilizó la técnica Recuperación de Epitopes inducida por calor (HIER) utilizando el reactivo Trilogy de Cell Marque lo que permitió el desparafinado, rehidratación y recuperación antigénica en forma simultánea. Luego los portaobjetos se lavaron con agua destilada y se incubaron con el anticuerpo primario (dilución 1:100) durante 1 hora a temperatura ambiente, y se lavaron con Tris-solución salina bufferada (TBS). El anticuerpo secundario (Cell Marque, Rockling, CA, USA) se aplicó durante 10 minutos y lavados nuevamente con TBS. El color fue desarrollado a los 5 minutos de incubación con el cromógeno. Por último las muestras fueron deshidratadas y cubiertas con un portaobjetos Las células tumorales fueron consideradas positivas para el antígeno Ki67, RE y PR si presentaban tinción marrón intranuclear.

Evaluación de la inmunomarcación:
Las muestras fueron evaluadas simultáneamente por dos observadores, primero a bajo aumento (×40) y luego, para el recuento de células con núcleos con tinción positiva, a gran aumento (x400). Se evaluaron 3000 células tumorales y se calculó el porcentaje de células con expresión positiva para Ki67 sobre el total de células tumorales evaluadas. Para los receptores hormonales se calculó el porcentaje de células con expresión positiva considerándose negativo un resultado de menos del 10% de células teñidas y positivo un resultado de más del 10% de células teñidas.

Análisis estadístico:
Se realizó un análisis descriptivo de la situación con medidas de posición y con el estudio de las frecuencias de distribución. Se determinó la prevalencia según el tumor (benigno/maligno). Se realizó análisis de varianza de los resultados obtenidos del estudio del índice mitótico, grado de anaplasia y de la marcación de Ki-67 entre los distintos tipos tumorales (benigno/maligno) por el método no paramétrico de Kruskal-Wallis. Se buscaron diferencias significativas entre medias por medio del test de comparación de medias de Kruskal-Wallis. Se analizó la correlación entre los resultados obtenidos de la marcación de Ki-67 y de la evaluación del índice mitótico y el grado de anaplasia. Se analizó la correlación entre los resultados obtenidos de la marcación de Ki-67 y de la de receptores hormonales. Para evaluar sobrevida global se empleó como método estadístico el análisis de supervivencia de Kaplan Meier. La comparación entre ellos se realizó mediante el Test de Logrunk y Cox-Mantel, considerándose significativos los p menores o iguales a 0,05.

Resultados:
Del total (n=46) de muestras histopatológicas de tumores mamarios resultaron malignos (n=39/46 84,78%) y benignos (n=7/46 15,22%). (Tabla N°1) Al relacionar el diagnóstico histopatológico (tumor maligno/ tumor benigno) con los resultados obtenidos del Ki-67 se observó una diferencia significativa entre ambos grupos (tumor maligno, n=39, x=27% / tumor benigno, n=7, x=4% p=<0,0001). Al relacionar el diagnóstico histopatológico (tumor maligno/ tumor benigno) con los resultados obtenidos de evaluar el índice mitótico se observó una diferencia significativa entre ambos grupos (tumor maligno, n=39, x=26,37% / tumor benigno, n=7, x=7,5% p=0,0001). Al relacionar el diagnóstico histopatológico (tumor maligno/ tumor benigno) con los resultados obtenidos de evaluar el grado de anaplasia se observó una diferencia significativa entre ambos grupos (tumor maligno, n=39, x=26% / tumor benigno, n=7, x=9,5% p=0,0007). (Tabla N°1) En cuanto a los receptores hormonales se observó una expresión negativa en el total de casos (n=7/7 100%) que integran el grupo de pacientes con tumores mamarios benignos, mientras que en el grupo de pacientes con tumores mamarios malignos se observó positividad para ER (n=5/39 12,82%), para RP(n=3/39 7,69%) y para ambos ER y RP (n=5/39 12,82%). (Tabla N°2)

En relación al grupo de pacientes con tumores mamarios malignos se observó una correlación positiva entre los resultados obtenidos de la marcación de Ki-67 y de la evaluación del índice mitótico (p==<0,0001) y el grado de anaplasia (p=0.03) y una correlación negativa con los resultados obtenidos de la marcación de receptores hormonales (p=0.001). El grupo de pacientes con tumores mamarios malignos con positividad para Ki-67 entre el 11 y el 39% (rango 1: baja positividad) mostró mejor pronóstico y mayor sobrevida global que el grupo de pacientes con positividad entre el 40 y el 65% (rango 2: alta positividad) con una mediana de 941 y 113 días respectivamente. (Gráfico N°1) Al evaluar, en el mismo grupo de pacientes, el índice mitótico se observaron diferencias significativas en los tres grupos (p=0.01) con una mediana se supervivencia de 1099, 230 y 120 para los grupos 1,2y 3 respectivamente. (Gráfico N°2) En relación al grado de anaplasia se observaron diferencias significativas en los tres grupos (p=0.01) con una mediana se supervivencia de 1092, 870 y 120 para los grupos 1,2 y 3 respectivamente. (Gráfico N°3)

Conclusiones:
Se observó acorde a lo reportado por autores de Medicina Humana y Veterinaria una correlación negativa entre la expresión de receptores hormonales y la expresión de Ki-67 en relación al grupo de pacientes con tumores malignos. Los autores consultados indican que el 80% de los tumores mamarios caninos expresan ER, PR o ambos y que los tumores malignos tienen una expresión más baja de receptores hormonales con respecto a los tumores benignos, lo cual no fue observado en este estudio en donde el porcentaje de positividad para la expresión de receptores fue mucho menor a lo esperado según estos reportes. Por otro lado el grupo de pacientes con tumores benignos no expresó positividad para receptores hormonales. Se desprende en virtud de las diferencias halladas, que son necesarios mayores estudios que involucren a un mayor número de pacientes. En concordancia con la bibliografía consultada, se observó una correlación positiva entre el IM y el grado de anaplasia con la marcación del Ki-67 con significancia desde el punto de vista estadístico. Pese a esto, a nivel individual se observó que un porcentaje de pacientes con altos niveles de Ki-67(entre 50 y 60%) no presentaron un IM y un grado de anaplasia 3 como era de esperarse. Esto puede deberse a que el IM evalúa la fase M del ciclo celular la cual representa la porción más corta del ciclo de división celular y para alcanzar un alto grado de precisión en la técnica es necesario contar el número de figuras mitóticas en más de 1000 células tumorales. Por otro lado se hace difícil la identificación de figuras mitóticas condensadas que, generalmente, son el resultado de la demora entre la toma de la muestra y el comienzo de la fijación. Los estudios patológicos de rutina relacionados con el comportamiento biológico del cáncer de mama como el IM y el grado de anaplasia, que dan cuenta del grado tumoral, son de gran utilidad en la predicción de la sobrevida pero presentan limitaciones. De ahí la necesidad de incorporar a los estudios rutinarios procedimientos inmunohistoquímicos que determinen el grado de expresión de Ki-67 en el tejido tumoral y con ello predecir con mayor especificidad el grado de proliferación, malignidad y capacidad de invasión de las células neoplásicas y por ende predecir mas objetivamente la sobrevida de cada paciente y sus opciones terapéuticas.

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